CIN及宮頸癌患者外周Treg/Th17細胞的表達及意義

陶 陶，高 嵩

(中國醫科大學附屬盛京醫院，遼寧 沈陽 110000)

宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)作為臨床上一類發病率較高的婦科惡性腫瘤，其發病率呈逐年上升趨勢，且逐漸呈現出低齡化，對患者的生活質量造成了較大的影響。目前，臨床上較為常用的CIN的方法較差，即需要采取積極有效的方法進行解決[1]。由于CIN存在著自然逆轉、持續不變或者進展成為宮頸癌的三個階段，而其中CIN及宮頸癌的免疫狀況則是將細胞免疫耐受作為主體，外周Treg/Th17細胞參與并維持著免疫平衡方面的作用，當這免疫平衡方面失去原有的平衡之后，則會導致患者的自身免疫性疾病以及腫瘤開始發生發展[2]。Treg能夠通過分泌出白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)及轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等多種細胞因子，Th17能夠分泌IL-17，IL-6則在Th17 細胞的分化形成過程中起著積極的促進作用，中國醫科大學附屬盛京醫院針對收治的CIN患者展開研究與分析，針對其外周Treg/Th17細胞的表達水平進行探討，結果報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取中國醫科大學附屬盛京醫院自2015年4年至2017年4月收治的30例CIN患者作為CIN組以及35例宮頸癌患者作為宮頸癌組，均經過病理實驗檢查后證實，術前均未接受常規放療及化療治療，同時也未服用過其他類型的藥物。另選擇同時收治的32例健康女性作為對照組，CIN組年齡在35～60歲，平均年齡為(47.1±3.9)歲，宮頸癌組年齡在33～62歲，平均年齡為(46.9±3.2)歲，對照組年齡在34～61歲，平均年齡為(46.3±3.5)歲，三組一般資料無明顯差異，具有可比性(P>0.05)。

1.2方法

采用流式細胞術對三組人員外周血單個核細胞中Th17細胞及Treg細胞的表達情況進行檢測，另采用酶聯免疫吸附法對外周Treg/Th17細胞相關因子IL-23、IL-10、IL-17、IL-6及TGF-β的濃度進行測量。Th17細胞的檢測方法為：將外周血單個核細胞提取出來后，進行RPMI1640培養，接種在24孔培養板后，向其中加入PMA刺激劑、離子霉素、蛋白質轉運劑等[3]。放置在37℃、5%的CO2培養箱中進行培養4h后，向其中加入FIFT-CD4抗體，給予避光孵育30min，行PBS洗滌2次，加入至固定液室內給予避光孵育30min，接著洗滌2次，最后向其中加入PE-IL-17抗體，并進行同型對照，于室溫條件下避光30min，使用破膜劑后上機檢測[4]。Treg細胞檢測方法為：取300μL的外周血，向其中加入8mL的紅細胞裂解液，共裂解12min后，給予離心處理，共離心5min，將上層清液去除后，加入2mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)沖洗液，搖均勻后，離心處理，1 500r/min，離心5min后，去除掉上層清液，搖勻后完成加入抗體、固定、破膜、封閉劑、孵育等一系列過程中，上機檢測[5]。外周Treg/Th17細胞相關因子的測量方法為：取得外周血標本2mL后，肝素抗凝處理，放置在離心機中，給予離心處理，離心速度為2 500r/min，共離心15min，后將上層清液放置在80℃的冰箱中保存[6]。采用酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法對血漿中IL-23、IL-10、IL-17、IL-6及TGF-β的濃度進行測量，測量的步驟嚴格按照說明書進行。

1.3統計學方法

2結果

2.1 Treg與Th17細胞在CIN及宮頸癌患者外周血中的表達水平

CIN組與宮頸癌組分別與對照組相比CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T細胞水平較高、CD4+IL-17+/CD4+T細胞表達水平較低，宮頸癌組與CIN組相比CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T細胞水平較高、CD4+IL-17+/CD4+T細胞表達水平較低，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

Table 1 Expression levels of Treg and Th17 cells in peripheral blood in CIN and cervical cancer patients(%,±S)

注：t1(P1)為對照組與CIN組相比.t2(P2) 為對照組與宮頸癌組相比.t3(P3)為CIN組與宮頸癌組相比。

2.2外周Treg/Th17細胞相關因子在CIN及宮頸癌患者外周血中的表達水平

CIN組與宮頸癌組分別與對照組相比IL-10、TGF-β水平較高，IL-17、IL-23及IL-6水平較低，宮頸癌組與CIN組相比IL-10、TGF-β水平較高，IL-17、IL-23及IL-6水平較低，差異均具有統計學意義(均P<0.05)，見表2。

表2 外周Treg/Th17細胞相關因子在CIN及宮頸癌患者外周血中的表達水平

注：t1(P1)：對照組與CIN組相比；t2(P2)：對照組與宮頸癌組相比；t3(P3)：CIN組與宮頸癌組相比。

3討論

3.1 CIN及宮頸癌的發生發展與細胞免疫功能的關系

據調查資料顯示，腫瘤的發生發展與人體的免疫功能具有密切的相關性，其中T淋巴細胞的存在在其中起到了重要的作用，而Treg細胞作為一類具有較強免疫抑制特性的T淋巴細胞亞群，能夠在外周免疫應答的調節過程中發揮重要的作用，并具有一定的臨床意義。有研究報道指出，CIN及宮頸癌的發病機制通常可受到機體的細胞免疫應答情況影響，能夠表現出免疫耐受的情況，當CD4+T細胞中出現Th1/Th2平衡向Th2方向偏離時，則會導致NK細胞中所存在的抑制性受體與殺傷性受體發生明顯的平衡失調的情況[7]。總結引起上述平衡失調的機制則在于Treg的調控作用，Treg的調控作用在于能夠對免疫耐受進行有效的誘導，并可促進機體免疫應答能力的明顯降低，同時促進增加炎癥反應，并顯著提高機體的防御反應等，一旦此種調節作用被打破，則易導致腫瘤的發生與進一步的發展[8]。

3.2 CIN及宮頸癌患者外周Treg/Th17細胞的表達及意義

Treg發揮其作用主要是通過分泌細胞因子中IL-10及TGF-β所完成實現，通過對NK細胞、樹突狀細胞及NKT等細胞進行有效的調節與觸控，從而使得機體免疫應答水平明顯降低[9]。而Th17細胞則通過產生大量的IL-6、IL-17等因子，促進機體免疫應答反應明顯上調，并對初始T細胞分化成為Treg的過程進行有效的促進與誘導，導致Treg/Th17的平衡發生偏離[10]。而當Treg/Th17的平衡發生偏離時則會引起CIN的進展甚至導致宮頸癌的發生與惡化[11]。本次研究結果顯示，CIN組與宮頸癌組分別與對照組相比CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T細胞水平較高，CD4+IL-17+/CD4+T細胞表達水平較低，宮頸癌組與CIN組相比CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T細胞水平較高,CD4+IL-17+/CD4+T細胞表達水平較低，差異具有統計學意義(P<0.05)。CIN組與宮頸癌組分別與對照組相比IL-10、TGF-β水平較高,IL-17、IL-23及IL-6水平較低，宮頸癌組與CIN組相比IL-10、TGF-β水平較高，IL-17、IL-23及IL-6水平較低，差異均具有統計學意義(均P<0.05)。結果提示，當CIN向著宮頸癌的方向進展時，Treg相關細胞因子的濃度會逐漸升高，而Th17相關因子的濃度則會逐漸降低，進一步確定了宮頸病變及宮頸癌中Treg/Th17失衡的情況，原因是當這種情況失衡后，腫瘤生長的炎性反應則會逐漸減弱，這就對腫瘤生長提供了有利的環境。

綜上所述，隨著CIN向著宮頸癌方向的發展，Treg/Th17的平衡開始偏離，這就可能導致了CIN的進展以及宮頸癌的發生發展，可能與二者參與了腫瘤免疫內環境的調節相關。由于本次研究樣本量較少，收集到的數據可能存在一定的差異，可通過進一步分析以獲得精確的結論。

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