結核分枝桿菌復合體PCR定量檢測技術的臨床應用研究

迪麗達爾?庫德熱提 高劍 黃巧玲 郭南 李慧 艾克拜爾?熱合曼（通訊作者）

（1新疆醫科大學基礎醫學院病原學教研室 新疆 烏魯木齊 830011）（2喀什地區結核病防治所 新疆 喀什 844000）（3新疆醫科大學基礎醫學院法醫學教研室 新疆 烏魯木齊 830011）

結核病是一種由結核分枝桿菌所引發的對人體造成慢性傳染性的疾病。WHO 2017年的報道指出[1]，印度結核病患病人數居世界第一位，其次是印度尼西亞和中國。新疆地區結核病流調結果顯示[2]，活動性肺結核患病率為1526.12人/10萬。結核病給社會經濟發展及社會穩定帶來很大的負面影響，所以能夠對結核疾病早發現早診斷是預防結核病的關鍵之所在。目前，較為常見的診斷方法主要有培養法、抗酸染色法和熒光定量PCR法，其中熒光定量PCR技術以其簡單快速，成本低廉，高靈敏度和高特異度等特點而被廣泛應用于傳染病的診斷，可以彌補傳統方法的某些缺陷。本研究通過采用熒光定量PCR技術分別對標準菌株、結核分枝桿菌PCR檢測標準品和結核病擬診病例痰標本進行PCR檢測，與傳統方法即痰涂片法，菌培養法進行比較，評價了結核分枝桿菌復合體核酸擴增熒光檢測法快速檢測痰標本的靈敏度和特異性。

1.資料和方法

1.1 一般資料

選取2015年4月—2016年8月在喀什地區結核病醫院進行治療的200例患者痰液標本200 份，其中肺結核患者119例作為試驗組，女性57例，男性62例，平均年齡35.8±7.9歲，平均病程2.4±1.4個月；非結核病患者81例作為對照組，女性37例，男性44例，平均年齡36.1±8.6歲，平均病程2.4±1.7個月。其中肺結核疾病患者都與肺結核的診斷標準[3]相符。對患者的痰液標本進行采集備用。

1.2 儀器和試劑

BIO-RAD IQ5熒光定量PCR儀（廣州東盛生物科技有限公司）；結核分枝桿菌復合體核酸擴增熒光檢測試劑盒(新疆阿爾森生物科技有限公司)；結核分枝桿菌分離和鑒定培養基（上海哈靈生物科技有限公司），分枝桿菌抗酸染色液（上海哈靈生物科技有限公司），DNA提取試劑盒QIAamp DNA mini（德國凱杰公司）。

1.3 方法

1.3.1痰涂片抗酸染色鏡檢 依照《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》進行常規方法操作，制作痰標本，染色后鏡檢分級計數。

1.3.2分枝桿菌培養和鑒定 痰標本在4%NaOH的消化后，在酸性羅氏培養基進行分枝桿菌的培養，利用PNB生長試驗對分枝桿菌的菌型進行鑒定，具體過程為從生長狀態良好的培養基上選取單一菌落制成菌液（10mg/mL），然后接種到PNB培養基上繼續培養，觀察盛裝狀況。分枝桿菌的培養和鑒定具體操作步驟依照《結核病診斷實驗室檢驗規程》進行。

1.3.3痰液中DNA提取和熒光定量PCR技術 取50mLPBS（pH=6.8）加入到4%NaOH進行消化的痰標本中，15分鐘后，離心（3000r/min）20分鐘，棄去上清液，加入50μLTE進行滅活20分鐘，然后沸水浴保持10分鐘，離心（12000r/min）5分鐘，取2μL上清液進行PCR擴增。按照PCR試劑盒操作說明書，將提取的樣本DNA加入PCR反應管,按規定循環參數進行PCR反應。利用陽性梯度標準品的CT值(循環閾值)所制作的標準曲線制定出樣品的DNA拷貝數。

1.4 統計學方法

數據采用SPSS20.0軟件進行分析，計數資料進行χ2檢驗，計量資料用均數±標準差(±s)表示，進行t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2.結果

（1）陽性率比較

在本實驗中，對200份標本進行檢測，其中熒光定量PCR法72（61%）顯陽性，培養法38（32%）顯陽性，涂片法28（24%）顯陽性，熒光定量PCR技術的檢出率最高,細菌培養法次之且檢測時間較長,涂片法檢出率最低，（見表）檢出率差異有顯著性（P＜0.05）。

（2）靈敏度與準確度

熒光定量PCR法的靈敏度為96.77%，準確度為96.01%。

表 肺部疾病患者的檢測結果（3種檢測方法陽性率統計）

3.討論

結核病的發病原因是感染了結核桿菌，一旦發病，會對各個器官造成嚴重影響，其中以肺結核最為多見。在我國，結核病的發病率較高，且徹底治愈較為困難[4]。對結核病進行早診斷早治療是能夠進一步控制結核病傳染的基礎，能夠有效的改善患者的預后情況。雖然細菌培養法和痰涂片法是目前臨床上常用的方法，但是細菌培養法耗時長，且靈敏度較低，又容易出現漏檢[5]。痰涂片法陽性率較低，尤其是對腦脊液標本，平均為10%(0～87%)[6]。熒光定量PCR法是當標本加入一條與靶基因序列互補的熒光雙標記寡核苷酸探針后能夠在出現特異性PCR擴增時有特異性的熒光出現。通過檢測熒光值的變化對擴增產物的量進行確定[7-9]。

在本實驗中，對200份標本進行檢測，其中，熒光定量法陽性檢出率最高，差異顯著（P＜0.05）。在靈敏度檢測中，熒光定量PCR法顯陽性高于培養法和涂片法，差異顯著（P＜0.05）。實驗結果表明熒光定量PCR法與傳統方法比較，檢出率較高，靈敏度好，特異性高。出現假陽性率的概率低，能夠在結核病早期作出快速診斷，對于臨床高度疑似病例而痰涂片和菌培養法都是陰性的患者以及對結核病患者治療后的療效監測都很適用，進一步為臨床效果和預后提供參考價值。綜上所述，熒光定量PCR技術檢測結核桿菌的應用效果較好，建議將熒光定量PCR法作為常規檢測，以提高結核分枝桿菌檢測的準確率。

[1]http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/zh/

[2]楊津明，杰恩斯·斯馬胡勒，邰新蓉，李月華，趙珍，新疆維吾爾自治區2010-2011年結核病流行病學抽樣調查結果分析。中國防癆雜志2013，Vol.35，No.12，960-964

[3]楊洪毅,石潔,劉國棟,等.熒光定量PCR技術在痰結核菌檢測中的應用[J].現代預防醫學,2013,40(8):1483-1484.

[4]王霖,王輝,李才信,等.熒光定量PCR技術在肺結核診斷中的應用研究[J].中國衛生標準管理,2016,7(11):169-171.

[5]杜彥懿，王平，張文莉，等.涂片鏡檢法與培養法檢測結核分枝桿菌的結果比較[J].內蒙古中醫藥，2011，31(24)：83-84.Du YY，Wang P，Zhang WL，et a1.Results of smear microscopv and culture methods to detect Mycobacterium tuberculosis comparison.[J]Nei Mollgol Journalof Traditional Chinese Medicine，2011，31(24)：83-84.

[6]胡忠義.結核性腦膜炎實驗室診斷進展[J].中華Il缶床醫藥，2002，22(3)：83—85.

[7]張賀偉.熒光定量PCR技術檢測結核桿菌臨床應用分析[J].醫藥.2016(4):00262-00262.

[8]金建東.熒光定量PCR檢測痰結核桿菌DNA及其臨床應用[J].齊齊哈爾醫學院學報，2010，31(22)：3565—3566.

[9]王雅寧.熒光定量PCR技術檢測結核桿菌臨床應用分析[J].實用預防醫學, 2012, 19(9):1404-1406.