固體和液體法在支原體檢測中的方法學(xué)評價

戶小均(通訊作者) 馬驥 李選靖

（1四川省綿陽市中心醫(yī)院檢驗科 四川 綿陽 621000）（2四川綿陽四0四醫(yī)院檢驗科 四川 綿陽 621000）

支原體常存在于泌尿生殖道（主要是Uu和Mh），導(dǎo)致非特異性尿道炎（NGU）。致病性支原體對人體上皮細胞具有極強的親和性支原體定位于人體呼吸道和生殖道黏膜，從而能造成黏膜的局部細胞損傷這可能是其致病原因[1]。現(xiàn)今檢測泌尿生殖道支原體的方法主要是培養(yǎng)法、免疫法和PCR法，但免疫法和PCR法操作復(fù)雜且價格較高，故目前國內(nèi)大多數(shù)實驗室檢測Uu和Mh的方法為培養(yǎng)法[2]。培養(yǎng)法分兩類，分別為固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法，而在國內(nèi)較常使用液體培養(yǎng)法。液體培養(yǎng)法對實驗條件要求不高，且操作簡捷，作為WHO推薦診斷NGU的首選方法[3]；傳統(tǒng)固體培養(yǎng)法成本相對較高、耗時長，雖有新型固體培養(yǎng)基應(yīng)用，縮短了培養(yǎng)時間，但也存在真菌污染情況，影響形態(tài)觀察[4]。由于固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法常出現(xiàn)檢測結(jié)果不一致的現(xiàn)象，本次研究對300例疑似泌尿生殖道支原體感染的標本同時進行固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)，比較兩種方法對Uu和Mh的檢測價值。

1.材料與方法

1.1 研究對象

300例樣本均來自2017年上半年本院疑似生殖道支原體感染者的泌尿生殖道分泌物。男性采用無菌拭子取尿道口1～1.5cm分泌物或尿沉渣（中段尿10～20ml，2000r/min離心10分鐘）；女性采用無菌拭子取宮頸口1～1.5cm處分泌物。

1.2 儀器與試劑

所選用的液體培養(yǎng)基為Uu和Mh選擇分離培養(yǎng)、鑒定、藥敏試劑盒，購自眾愛生河北生物科技有限公司；固體培養(yǎng)基Uu和Mh的選擇分離培養(yǎng)基，購自眾愛生河北生物科技有限公司）。儀器選擇普通光學(xué)顯微鏡和隔水恒溫培養(yǎng)箱。

1.3 實驗方法

標本在收集后盡量在2小時內(nèi)接種。固體培養(yǎng)：將標本拭子直接滾動連續(xù)劃線涂布在固體培養(yǎng)基上，并加一片二氧化碳發(fā)生片，編號后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。液體培養(yǎng)：取未接種的培養(yǎng)基液100μl加入陰性對照孔，然后將標本拭子頭置于液體培養(yǎng)液內(nèi)充分洗滌并在瓶壁上擠干拭子，然后各取100μl滴加在除陰性對照孔的其余各孔中，滴加石蠟油覆蓋，編號后放入培養(yǎng)箱35～37℃培養(yǎng)，24～48小時后觀察結(jié)果。

1.4 結(jié)果判斷

1.4.1液體培養(yǎng)結(jié)果判定 鑒定孔無顏色變化且無混濁則為陰性；鑒定孔由黃色變成紅色且無渾濁則判定為陽性。若陽性孔出現(xiàn)混濁或鑒定孔陽性而陽性孔為陰性則視為液體培養(yǎng)污染。

1.4.2固體培養(yǎng)結(jié)果判定 培養(yǎng)24～48小時后在低倍鏡下觀察培養(yǎng)基上是否生長支原體屬特征菌落，若觀察到較大且為油煎蛋狀支原體菌落則為Mh陽性；若觀察到較小且呈圓形棕褐色支原體菌落則為Uu陽性；若兩者都有則為Uu+Mh陽性；若無典型支原體屬特征菌落生長則為陰性；有雜菌生長并影響到結(jié)果觀察的判為固體培養(yǎng)污染。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行χ2分析，P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)陽性檢測率

液體培養(yǎng)及固體培養(yǎng)結(jié)果見表1、表2，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗兩種培養(yǎng)法對泌尿生殖道支原體檢測結(jié)果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.621，P＜0.05）。

表1 固體培養(yǎng)法與液體培養(yǎng)法檢測結(jié)果

表2 固體培養(yǎng)法與液體培養(yǎng)法陽性率

2.2 固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)污染率

液體培養(yǎng)及固體培養(yǎng)污染率見表3，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，液體培養(yǎng)法污染率高于固體培養(yǎng)法（χ2=10.173，P＜0.05）。

表3 固體培養(yǎng)法與液體培養(yǎng)法污染率

3.討論

泌尿生殖道支原體檢測的常用方法為液體培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法，本研究采用液體培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法來檢測300例疑似泌尿生殖道支原體感染的標本，結(jié)果顯示液體培養(yǎng)法陽性率高于固體培養(yǎng)法，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其原因主要是液體培養(yǎng)法是生化反應(yīng)，特異性差，Uu或Mh在培養(yǎng)基中生長時，會分解尿素或精氨酸，產(chǎn)生氨氣使培養(yǎng)基pH上升，令酚紅指示劑由黃色變?yōu)榧t色，從而確定有Uu或Mh生長；然而這種反應(yīng)不是支原體特有的，當培養(yǎng)液中存在可以分解尿素或精氨酸的其他細菌和真菌時，都會出現(xiàn)陽性反應(yīng)；而固體培養(yǎng)法特異性高，只有觀察到典型的Uu或Mh才能判定為陽性，這就造成了液體培養(yǎng)法陽性率高于固體培養(yǎng)法。此外，根據(jù)吳清壇研究報告可得出液體培養(yǎng)法敏感性高于固體培養(yǎng)法，這亦是固體培養(yǎng)陽性率高于固體培養(yǎng)的原因之一；同時，由于固體培養(yǎng)時間過長，若未培養(yǎng)足夠的時間，則支原體可能未生長或不明顯，這亦會導(dǎo)致固體培養(yǎng)的陽性檢測率低。

液體培養(yǎng)對于確診Uu的假陽性率為10.85%（14/129）；液體培養(yǎng)對于確診Mh的假陽性率為42.85%（6/14）。可見液體培養(yǎng)法檢測泌尿生殖道支原體更易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。分析出現(xiàn)假陽性結(jié)果的原因主要有兩個：液體培養(yǎng)基不能完全抑制或殺滅其他具有耐藥性的微生物，而這些微生物恰好能分解尿素和精氨酸，產(chǎn)生氨氣致使培養(yǎng)基變紅而出現(xiàn)假陽性的結(jié)果；某些堿性標本亦會導(dǎo)致培養(yǎng)液由黃色變?yōu)榧t色，繼而出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。

此外，有5例標本液體培養(yǎng)為陰性而固體培養(yǎng)為陽性，這是由于采集的標本支原體量少或標本在培養(yǎng)液中未將支原體充分洗脫下來，導(dǎo)致培養(yǎng)時支原體含量太少，在培養(yǎng)24-48小時內(nèi)不能產(chǎn)生足夠的氨氣致使酚紅指示劑不變色或顏色變化程度不大，以致于結(jié)果判為陰性；標本上攜帶其它細菌、細胞或真菌導(dǎo)致標本污染，使培養(yǎng)液渾濁視為污染而判定為陰性。此外，液體培養(yǎng)中先滴加抗生素包被的微孔再滴加陽性孔和鑒定孔，若往抗生素包被的微孔滴加培養(yǎng)液時污染了加樣槍頭且未更換槍頭，從而污染了培養(yǎng)液導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)果為陰性。

結(jié)果顯示固體培養(yǎng)污染率小于液體培養(yǎng)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。造成污染的原因可能是：（1）標本問題：若采集的標本上有雜菌、細胞或真菌，使得培養(yǎng)液混濁而將培養(yǎng)結(jié)果判為污染；（2）接種時的污染：固體培養(yǎng)接種快捷，接種完加入二氧化碳發(fā)生片后立即封閉，大大減少了其他雜菌污染培養(yǎng)基，干擾結(jié)果的可能性；而液體培養(yǎng)接種過程中，不僅需要在陽性孔，陰性孔和鑒定孔滴加培養(yǎng)液，還需要在多個以高低濃度抗生素包被的微孔中加入培養(yǎng)液，這樣增加了接種時間，加大了雜菌污染培養(yǎng)基的機率。

綜上所述，液體培養(yǎng)法操作更方便，附帶鑒定和藥敏試驗?zāi)芊从持гw感染程度及耐藥性，指導(dǎo)臨床合理用藥，但易漏診和誤診；固體培養(yǎng)法特異性強，能直觀觀察支原體典型菌落，污染率小且不易漏診和誤診，是確診支原體感染的方法，但培養(yǎng)時間過長。因此，兩種方法各有優(yōu)劣，臨床應(yīng)聯(lián)合兩方法檢測支原體，才能有效，快速，準確地檢測出是否為支原體感染及感染程度，這對感染早期的確診以及治療具有十分重要的作用。

[1]陳忠領(lǐng)，羅凱亮.女性生殖道支原體感染及耐藥性分析[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（5）：599-600.

[2]黃秀榮，張群先.液體法和固體法檢測泌尿生殖道支原體的效果[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2017，17(2)：207-209.32

[3]毛得斌.泌尿生殖道支原體感染檢測及藥敏分析進展[J].右江醫(yī)學(xué)，2015，43（5）:637-640.

[4]張艷，李蘇利.Uu檢測方法研究現(xiàn)狀[J].臨床軍醫(yī)雜志，2014，42（9）:961-963.