黑米發芽的工藝條件研究

付 欣，魯 明，王小鶴，于 淼

（遼寧省農業科學院 食品與加工研究所，沈陽 110161）

黑米為米中珍品，入口香甜醇厚，質地好。黑米營養豐富，含有黑米色素、氨基酸、B族維生素、蛋白質、礦物元素等功能性成分，而白米中的這些成分幾乎不含或含量較少。但黑米口感粗糙，降低了人們對它的喜愛程度。研究表明，發芽處理可使黑米組織軟化，提高加工性、適口感和商品價值。以黑米為原料，采用不同條件進行黑米發芽，根據發芽過程中的蛋白酶活力變化，確定黑米發芽的最佳工藝條件，以期為黑米發芽工藝提供理論基礎和參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米由遼寧省稻作研究所提供。

三氯乙酸（TCA）、磷酸二氫鈉、氯化鈣均為分析純，由國藥集團化學試劑有限公司生產。醋酸緩沖液（pH3.6）標準品，由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司生產。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；LXJ-ⅡB型離心機：上海安亭科學醫學儀器廠；電熱恒溫培養箱：上海躍進醫療器械廠；電子天平：北京賽多利斯儀器有限公司；HH-601A型水浴鍋：江蘇金壇榮華儀器公司

1.3 單因素試驗

1.3.1 黑米發芽處理方法取篩選除雜后的黑米，用0.5%的次氯酸鈉溶液浸泡30 min，再用去離子水沖洗。待糙米表面干燥后，分別用0.5 mmol／L氯化鈣（Ca2+）和自來水浸泡24 h，每隔8 h撈出放置1 h。

在培養皿中放置3層紗布，再放入處理好的黑米，用3層紗布蓋在表面，置于培養箱內（黑暗條件下）發芽。每天在表面噴灑1～2次水，確保黑米處于濕潤狀態。每個試驗重復3次。

1.3.2 浸泡溫度、時間對黑米吸水率的影響將黑米樣品分成4份，用紗布包好，放入裝有無菌水的燒杯中，分別置于20，25，30，35℃恒溫水浴鍋，每4 h取出晾干稱重，計算黑米的吸水率。

1.3.3 浸泡溫度、時間對黑米發芽率的影響取黑米樣品4份，分別放入 20，25，30，35 ℃的無菌水中浸泡，每隔6 h定量取出，在22℃培養箱中發芽48 h，計算發芽率。

1.3.4 前處理Ca2+濃度對蛋白酶活力的影響取20 g黑米樣品7份，分別放入100 mL無菌水，以及滅菌后的0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mmol／L Cacl2溶液中， 于 28℃下浸泡24 h，放入培養箱（22℃）發芽，測定其蛋白酶活力。

1.3.5 溫度對蛋白酶活力的影響取 300 g黑米樣品，用28℃的1 000 mL無菌水浸泡24 h；取出，分成等重6份， 分別置于 14，18，22，26，30，34 ℃的培養箱發芽，考察發芽溫度對黑米蛋白酶活力的影響。

1.3.6 時間對黑米發芽過程中蛋白酶活力的影響取350 g黑米，在28℃下用1 000 mL無菌水浸泡24 h；取出，分成等重7份，放入22℃培養箱中發芽，在1，2，3，4，5，6，7 d 分別取出一份發芽黑米，測定蛋白酶活力，考察發芽時間對黑米蛋白酶活力的影響。每個試驗重復3次。

1.4 響應面法試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選取3個影響最顯著的因素為自變量，應用Box-Behnken設計響應面試驗，設計因素水平見表1。采用Design-Expert8.0.5b對試驗數據進行優化分析。

表1 響應面設計因素水平Table 1 Factor levels of RSD

1.5 蛋白酶活力測定

1.5.1 酪氨酸標準曲線取 18支試管，分成 6組（每組3支，平行樣）并編號，分別加入標準酪氨酸、去離子水、濃度0.4 mol／L的碳酸鈉溶液和福林-酚試劑，混勻，置于40℃水浴保溫20 min，用分光光度計進行比色測定（波長660 nm）。以酪氨酸反應液作為空白對照，繪制標準曲線。

1.5.2 蛋白酶活力測定方法參照Harvey等的測定方法并稍做修改。稱取2.00 g發芽黑米，冰浴條件下加8 mL醋酸緩沖液研磨勻漿，在4℃、10 000 r／min條件下離心30 min，上清液即為蛋白酶粗提液。

在40℃下取酪蛋白底物、蛋白酶粗提液各1 mL，保溫10 min，在90℃水浴條件下滅酶5 min，加入 0.4 mol／LTCA溶液 2 mL， 常溫下放置 15 min沉淀殘余蛋白質，4 500 r／min離心15 min，取上清液，在波長275 nm處測定吸光值。

以酪氨酸為標準，將1.00 g發芽黑米蛋白酶粗提液催化酪蛋白每分鐘產生1 μg酪氨酸定義為1個蛋白酶活力單位（U）。以反應前先加入TCA溶液的體系為對照。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 溫度和前處理對黑米芽長的影響脫殼后的黑米是完整的植物種子，富含營養物質和生命物質，在適宜的溫度、水分條件下就會發芽。不同發芽溫度及前處理方法對黑米芽長的影響見表2。

表2 黑米發芽過程中的芽長變化Table 2 Bud length change during germination of black rice ／mm

由表2得出，黑米在溫度較高的環境中長芽更快，芽長更長。在22℃條件下，用Ca2+處理的黑米比用去離子水處理的黑米長芽趨勢好。

2.1.2 浸泡溫度和時間對黑米吸水率的影響適宜的浸泡溫度和時間，利于黑米充分吸水，浸泡溫度和時間對黑米吸水率的影響見圖1。

圖1 浸泡溫度和時間對吸水率的影響Figure 1 Effect of immersion temperature and time on the water absorption rate of black rice

從圖1可以看出：浸泡溫度和浸泡時間對黑米的吸水率影響較大；隨著浸泡溫度的提高，黑米吸水飽和時間逐漸縮短；在35℃下浸泡25 h后，黑米的吸水率基本達到飽和。

2.1.3 浸泡溫度和時間對黑米發芽率的影響發芽率與浸泡溫度、浸泡時間的關系見圖2。

圖2 浸泡溫度和浸泡時間對發芽率的影響Figure 2 Effect of immersion temperature and time on the germination rate of black rice

由圖2可知：當浸泡時間為6～18 h時，隨著浸泡溫度的提高，黑米的發芽率有小幅度增加；在35℃下浸泡 18 h、25～30℃浸泡 24 h、20℃浸泡 30 h后，發芽率達到最高值；此后，隨著浸泡時間的延長，發芽率反而降低。綜合考慮，選擇浸泡溫度25～30℃，浸泡時間20～24 h為宜。

2.1.4 Ca2+濃度對蛋白酶活力的影響在 22℃條件下，將不同濃度Ca2+浸泡的黑米放入培養箱 （黑暗條件）發芽。Ca2+濃度對蛋白酶活力的影響見圖3。

圖3 不同Ca2+濃度對蛋白酶活力的影響Figure 3 Effect of different Ca2+concentration on protease activity

如圖 3 所示，當 Ca2+濃度低于 0.6 mmol／L 時，黑米中的蛋白酶活力隨Ca2+濃度增高逐漸增加；當Ca2+濃度大于0.6 mmol／L時，蛋白酶活力逐漸降低。所以選擇0.6mmol／L的Ca2+進行黑米發芽前處理。

2.1.5 溫度對蛋白酶活力的影響溫度對蛋白酶活力的影響見圖4。

圖4 不同溫度對蛋白酶活力的影響Figure 4 Effect of different temperatures on protease activity

由圖4可知：發芽期間，黑米蛋白酶活力隨著溫度升高而顯著增加，在22℃時達最大值，之后開始下降。因此選擇22℃作為黑米發芽溫度。

2.1.6 時間對蛋白酶活力的影響發芽時間對黑米發芽過程中蛋白酶活力的影響如圖5所示。

圖5 不同發芽時間對黑米發芽過程中蛋白酶活力的影響Figure 5 Effect of different germination time on protease activity of black rice during germination

由圖5可知：蛋白酶活力隨著發芽時間的增加總體呈上升趨勢，在第5 d達到最大值，之后逐漸降低。最佳發芽時間為5 d。

2.2 響應面試驗設計

響應面試驗設計及結果見表3。利用Design-Expert8.0.5b對試驗數據進行優化分析，得出3因素與蛋白酶活力（Y）之間的回歸方程式：

Y ＝350.58+11.19A+25.59B+21.63C-2.25AB-2.87AC-14.43BC-41.64A2-74.64B2-63.81C2響應面試驗方差分析結果見表4。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of RSD test

表4 響應面試驗方差分析結果Table 4 Variance analysis results of RSM test

P值的大小體現顯著性檢驗結果，當模型P值小于0.05時，表明在統計學上是有意義的。通過表4結果可知，該模型 P＜0.05，說明具有統計學意義，且二次項 A2，B2，C2極顯著（P＜0.0001）。

失擬項表示所用模型與試驗擬合的程度，表4中的失擬項 P 值為 0.8956＞0.05，表明失擬不顯著。 模型的校正決定系數 R2adj＝0.9834，說明模型能解釋約98.34%響應值的變化；決定系數 R2＝0.9927，說明模型擬合度較好，試驗誤差小，可以利用該回歸方程確定黑米最佳發芽條件。

Ca2+濃度、發芽溫度、發芽時間三個因素對黑米發芽過程中蛋白酶活力的影響見響應面曲面圖6——8。

由圖6——8可以看出：響應面存在極值；通過Design-Expert8.0.5b 軟件分析可得，當 Ca2+濃度 0.51 mmol／L、發芽溫度 22.62 ℃、發芽時間為 5.15 d 時，蛋白酶活力為 354.867 U。

考慮實際操作，對結果進行修正得到的黑米發芽最佳工藝條件為：Ca2+濃度 0.5 mmol／L、發芽溫度 22℃、發芽時間5 d。驗證試驗表明，此工藝條件下的蛋白酶活力為 347.5 U。

圖6 Ca2+濃度-發芽溫度對黑米發芽過程中蛋白酶活力的影響Figure 6 Effect of Ca2+concentration and temperature on protease activity of black rice during germination

3 結論

通過單因素試驗篩選出Ca2+濃度、發芽溫度、發芽時間作為響應面試驗因素，應用響應面分析3個因素對黑米發芽過程中蛋白酶活力的影響，確定影響順序為發芽溫度＞發芽時間＞Ca2+濃度。黑米發芽的最佳工藝條件為：Ca2+濃度 0.5 mmol／L、發芽溫度 22 ℃、發芽時間5 d。在此工藝條件下，蛋白酶活力為347.5 U。

圖7 Ca2+濃度-發芽時間對黑米發芽過程中蛋白酶活力的影響Figure 7 Effect of Ca2+concentration and germination time on protease activity of black rice during germination

圖8 發芽溫度-發芽時間對黑米發芽過程中蛋白酶活力的影響Figure 8 Germination temperature and time on protease activity of black rice during germination