EDTA依賴性血小板假性減少的分析與處理

黃小紅，林晉，郜秋芳，王小中

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330006)

目前全自動(dòng)血液分析儀因操作簡(jiǎn)便、速度快、計(jì)數(shù)準(zhǔn)確、重復(fù)性好，在臨床檢驗(yàn)工作中被廣泛應(yīng)用。血細(xì)胞分析是臨床常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，而乙二胺四乙酸鹽(EDTA)由于其對(duì)血細(xì)胞形態(tài)影響較小，適用于血液學(xué)檢查，尤其是血小板計(jì)數(shù)，被國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì) (international committee for standardization of hematology，ICSH)推薦為血細(xì)胞計(jì)數(shù)的一種抗凝劑，然而EDTA偶爾能引起血小板聚集而使血液分析儀不能正確辨別，使血小板測(cè)得值顯著低于真實(shí)值，使血小板假性減少，稱為EDTA依賴性血小板假性減少 (EDTA-dependent pseudothrombocytopenia EDTA-PTCP)現(xiàn)象。 EDTAPTCP現(xiàn)象容易被誤認(rèn)為血小板減少血液性疾病，從而造成誤診誤治，給臨床及患者帶來不必要的麻煩，本文對(duì)我室檢驗(yàn)工作中發(fā)現(xiàn)的5例EDTAPTCP現(xiàn)象及相關(guān)處理辦法進(jìn)行分析和總結(jié)。

1 資料和方法

1．1 一般資料 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院2017年4月至2017年6月底門診和住院患者EDTA-K2抗凝靜脈血2ml，通過實(shí)驗(yàn)室復(fù)檢規(guī)則和血涂片鏡檢結(jié)果篩選出6例鏡下血小板聚集的患者，其中男2例，女4例，標(biāo)本的采集嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第4版）進(jìn)行。6例患者體格檢查均無出血點(diǎn)、紫癜等，肝脾無腫大，凝血功能檢測(cè)均正常。

1．2 儀器與試劑 采用希森美康sysmex-XN9000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及其原裝的配套試劑，EDTA-K2抗凝、肝素鈉抗凝、枸櫞酸鈉凝真空采血管，潔凈的玻璃管。準(zhǔn)備人工計(jì)數(shù)的草酸銨稀釋液、瑞氏染液、牛鮑計(jì)數(shù)板、玻片及OLYMPUS顯微鏡，草酸銨稀釋液及瑞氏染液按照 《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第4版）配制。

1．3 方法

1．3．1 儀器法 分別用 EDTA-K2、肝素、枸櫞酸鹽抗凝管采集患者靜脈血2ml，充分混勻，立即上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)前用配套的血液分析質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)控檢測(cè)，室內(nèi)質(zhì)控在控后進(jìn)行標(biāo)本檢測(cè)，檢測(cè)前、中、后儀器狀態(tài)良好。血小板的參考范圍是(100-300)×109/L。

1．3．2 儀器稀釋法 取清潔小試管1支加入300ul的CELLPACK DCL稀釋液，采集末梢血50ul入準(zhǔn)備好的玻璃試管中，擦去管外余血，置于稀釋液中，充分混勻，立即采用sysmex-XN9000的稀釋模式進(jìn)行測(cè)試。該項(xiàng)測(cè)定方法已通過15189實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證，且與sysmex-XN9000儀器靜脈全血檢測(cè)比對(duì)，比對(duì)通過。

1．3．3 手工法 用血小板稀釋液草酸銨稀釋采集的末梢血20ul，按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第4版）操作人工計(jì)數(shù)。取清潔小試管1支加入0．38ml 1%草酸銨稀釋液；準(zhǔn)確采集患者末梢血20μl，擦去管外余血，置于試管內(nèi)，立即充分混勻，室溫靜置，待完全溶血后再次混勻1min；取均勻的血小板懸液1滴，充入計(jì)數(shù)池內(nèi)，放置10min～15min，待血小板下沉后在1h內(nèi)完成計(jì)數(shù)。

1．3．4 瑞氏染色 分別對(duì) EDTA-K2、肝素鈉、枸櫞酸鈉抗凝血及末梢血涂片，用瑞氏染液進(jìn)行染色，用顯微鏡觀察血小板的形態(tài)、分布情況及有無聚集現(xiàn)象。

2 結(jié)果

6例患者均排除采血原因、儀器故障導(dǎo)致的血小板減少。EDTA-K2抗凝血常規(guī)報(bào)告中白細(xì)胞、紅細(xì)胞均正常，單獨(dú)出現(xiàn)血小板減低，且血小板直方圖均存在異常，有2例患者白細(xì)胞直方圖出現(xiàn)明顯異常，血涂片鏡檢1例患者出現(xiàn)血小板衛(wèi)星現(xiàn)象，其他5例出現(xiàn)血小板聚集，6例患者都由血涂片證實(shí)血小板假性減少。1例患者出現(xiàn)肝素、枸鹽酸鹽抗凝血血小板仍低下，儀器稀釋及手工計(jì)數(shù)血小板正常，是多種抗凝劑引起的假性血小板減低。另外5例用肝素鈉、枸鹽酸鈉、儀器稀釋及手工法血小板數(shù)量處于正常范圍，并且血小板直方圖無明顯異常。明確有5例是由EDTA引起的血小板假性減少，結(jié)果見表1。

3 討論

EDTA-PTCP是一種發(fā)生在體外的血小板聚集現(xiàn)象，國內(nèi)外研究報(bào)道EDTA-PTCP的發(fā)生率為0．07%～0．2%[1-4]， 不少報(bào)道顯示這種現(xiàn)象不僅發(fā)生在健康個(gè)體，也發(fā)生在惡性腫瘤、慢性肝病、自身免疫病及心血管疾病[5]。雖然發(fā)生率低，卻給臨床工作帶來困擾。

目前EDTA-PTCP的發(fā)生機(jī)制至今仍不明確，Gowland[6]率先提出可能血清中存在某些抗體使血小板聚集和EDTA改變血小板表面結(jié)構(gòu)的假說，自此血小板的聚集逐漸引起大家關(guān)注。目前普遍認(rèn)為EDTA螯合鈣離子，使血小板活化從而發(fā)生形態(tài)的改變，導(dǎo)致血小板膜蛋白GPⅡb/Ⅲa異二聚體構(gòu)像發(fā)生改變，同時(shí)也使得血小板隱匿抗原的暴露，經(jīng)過一系列通路導(dǎo)致血小板膜上的磷脂酶A2活化，該酶會(huì)激活花生四烯酸（ASA）代謝通路，最終形成導(dǎo)致血小板聚集的血栓烷A2，活化血小板纖維蛋白原受體，促使血小板與纖維蛋白原聚集成團(tuán)[7-9]。仝德勝[10]等研究者認(rèn)為在EDTA-K2作用下出現(xiàn)的免疫介導(dǎo)血液中的冷抗血小板自身抗體，使血小板發(fā)生凝聚。

表1 6例患者血小板檢測(cè)及涂片鏡檢結(jié)果（×109/L）

在平常的檢驗(yàn)工作中，用血細(xì)胞分析儀對(duì)EDTA抗凝的標(biāo)本進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，要特別重視血小板減少的現(xiàn)象，尤其是單獨(dú)的血小板減低，仔細(xì)觀察標(biāo)本有無凝塊，認(rèn)真查看血液分析儀圖形及報(bào)警提示，同時(shí)涂片鏡檢觀察有無大血小板及聚集現(xiàn)象，及時(shí)與臨床溝通有無采血不順暢及患者有無出血癥狀。排除其他原因造成血小板假性減低，如發(fā)現(xiàn)血小板聚集，可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行解決：一、重抽血復(fù)查，用不同的抗凝劑進(jìn)行比對(duì)，如肝素、枸鹽酸鹽等，并同時(shí)進(jìn)行涂片染色鏡檢，避免因?yàn)镋DTA引起的血小板假性減少的發(fā)生，有研究顯示換用MgSO4也能有效解決血小板計(jì)數(shù)問題[11]。然而換用抗凝劑只能解決EDTA引起的血小板聚集，對(duì)多種抗凝劑引起的聚集現(xiàn)象不起作用，比如我們的研究患者1換用抗凝劑就不能很好的得到正確的報(bào)告，此方法不宜作為首選。二、儀器稀釋法，采用全血或末梢血置于稀釋液中，再上機(jī)檢測(cè)，能很好的避免人工計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確的弊端，但是這種方法須立即置于稀釋液中和上機(jī)檢測(cè)，否則離體的血液會(huì)凝固引起計(jì)數(shù)誤差。三、手工計(jì)數(shù)，采取末梢血和草酸銨稀釋液以一定的比例進(jìn)行稀釋，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，此方法雖然操作較為復(fù)雜，對(duì)人員要求高，但對(duì)EDTA-PTCP有效，而且對(duì)其他抗凝劑引起的血小板聚集也有效，手工計(jì)數(shù)常作為首選方法。四、有文獻(xiàn)報(bào)道，在不改變抗凝劑的情況下，加入阿米卡星可以使已經(jīng)聚集的血小板發(fā)生解聚[12，13]。加入阿米卡星可以減少患者重復(fù)采血，避免麻煩。張莉[14]研究顯示加入阿米卡星須在30min內(nèi)完成，超過30min對(duì)血小板解聚作用弱，而常菁華[15]等人證明不同患者對(duì)阿米卡星有敏感型和加速型，加入阿米卡星須在4h完成，在1h內(nèi)能達(dá)到理想效果，否則達(dá)不到解聚作用。

總之，臨床工作中，雖然EDTA-PTCP發(fā)生率小，但仍應(yīng)引起檢驗(yàn)工作者的重視，血小板結(jié)果的準(zhǔn)確性直接影響患者的診斷和治療，漏檢EDTAPTCP，會(huì)給醫(yī)生帶來錯(cuò)誤的指導(dǎo)，導(dǎo)致誤診、錯(cuò)治，給患者帶來不必要的檢查及心理負(fù)擔(dān)，應(yīng)加強(qiáng)檢驗(yàn)與臨床的溝通，不能過分依賴儀器檢測(cè)，細(xì)胞形態(tài)學(xué)鏡檢不容忽視，且EDTA-PTCP發(fā)生的機(jī)制不是很明確，仍有待進(jìn)一步研究。

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