蛋白芯片法與化學(xué)發(fā)光法在檢測(cè)消化道腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性分析

馬永能，彭秀娟，楊自力，劉姍，任皓月，曾華軍，陳娟娟，劉國(guó)雄

(綿陽(yáng)市第三人民醫(yī)院（四川省精神衛(wèi)生中心）檢驗(yàn)科，四川 綿陽(yáng) 621000)

腫瘤標(biāo)志物是指在腫瘤發(fā)生和增殖過(guò)程中異常升高的能反映腫瘤存在的化學(xué)類物質(zhì)。腫瘤標(biāo)志物在正常人含量很低，當(dāng)腫瘤發(fā)生時(shí)其在血液中的濃度明顯升高。由于單個(gè)腫瘤標(biāo)志物對(duì)相關(guān)疾病的診斷靈敏度和特異性的問(wèn)題，采用多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)能提高檢測(cè)的靈敏度和特異性，減少漏診和誤診[1-3]。目前蛋白芯片法由于其具有多指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于腫瘤高危人群的篩查、腫瘤病人術(shù)后的復(fù)發(fā)評(píng)估中。蛋白芯片法是基于蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)與化學(xué)發(fā)光免疫分析法聯(lián)合檢測(cè)人血清中的多種腫瘤標(biāo)志物，如CA19-9、CA125、T-PSA、F-PSA、NSE、AFP、CEA、CA724、Cyfra21-1、PG I、PG II、pro-GRP 等 12 種腫瘤標(biāo)志物。能對(duì)常見的腫瘤（肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤、前列腺癌等）進(jìn)行臨床輔助診斷及治療效果的預(yù)后監(jiān)測(cè)。

消化道腫瘤是常見的惡性腫瘤之一，其相關(guān)標(biāo)志物 CA19-9、AFP、CEA、CA724 被廣泛關(guān)注[4-6]。本文擬采用蛋白芯片和本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用成熟的化學(xué)發(fā)光法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)蛋白芯片多腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)法與本實(shí)驗(yàn)室已開展成熟的的貝克曼化學(xué)發(fā)光儀和羅氏電化學(xué)發(fā)光法在單一消化道腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)上的可比性。

1 資料與方法

1．1 試驗(yàn)對(duì)象 正常對(duì)照組：選擇健康體檢者，該組人群無(wú)明確的腫瘤病史和其他常見慢性疾病史，相關(guān)常規(guī)體檢和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果均在正常范圍內(nèi)。良性疾病對(duì)照組：選擇的血清樣本來(lái)源于患有除惡性腫瘤外的其他消化道疾病的住院病人。這些良性疾病包括肝炎、肝硬化、胃潰瘍、萎縮性胃炎、腸炎等。因?yàn)檠装Y的存在，該組患者的血清樣本可能會(huì)出現(xiàn)單一檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性。惡性腫瘤組：該組是臨床已確診的惡性腫瘤患者，包括：食道癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌消等化道腫瘤患者。

1．2 樣本的采集與保存 采集受試者血液3～5ml，3500r/min，離心10min分離血清，每份血清體積不小于500μl。溶血樣本和黃疸血樣本不宜檢測(cè)。盡量采用新鮮血清，若樣本當(dāng)天不檢測(cè)而在一周內(nèi)檢測(cè)，則應(yīng)放置在2～8℃保存；檢測(cè)前樣品應(yīng)與室溫平衡。

1．3 樣本的排除標(biāo)準(zhǔn)和數(shù)據(jù)剔除標(biāo)準(zhǔn) 溶血、高膽紅素、高血脂或黃疸血的樣本；類風(fēng)濕因子陽(yáng)性的樣本。

1．4 試劑和方法 蛋白芯片法試劑：江蘇三聯(lián)生物工程有限公司生產(chǎn)的SLXP-001型全自動(dòng)生物芯片閱讀儀及配套的蛋白芯片試劑盒。標(biāo)準(zhǔn)方法試劑及儀器：⑴羅氏診斷產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)的腫瘤標(biāo)志物定量檢測(cè)試劑盒：CA724試劑及其定標(biāo)品，儀器為Roche電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀Cobas e 411；⑵貝克曼有限公司生產(chǎn)的腫瘤標(biāo)志物定量檢測(cè)試劑盒（CA19-9、AFP、CEA等）及其定標(biāo)品，儀器采用DXI800全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。以上操作均按相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)產(chǎn)品說(shuō)明書和本實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程進(jìn)行。室內(nèi)質(zhì)量控制 （精密度控制）采用伯樂(lè)第三方質(zhì)控品，按照質(zhì)量管理體系控制室內(nèi)質(zhì)量控制；參加衛(wèi)生部室間質(zhì)量評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)各檢測(cè)項(xiàng)目的準(zhǔn)確性。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1．5．1 定性結(jié)果的一致性分析 對(duì)檢測(cè)結(jié)果的陰陽(yáng)性判斷，對(duì)照方法（考核試劑盒）采用的試劑盒以“男芯”試劑盒提供的參考數(shù)值為判斷依據(jù)，標(biāo)準(zhǔn)方法（參比試劑盒）采用的試劑盒則以廠家提供的單指標(biāo)檢測(cè)設(shè)定的參考值（Cut off）作為判斷依據(jù)，詳見表1。

表1 腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的陰陽(yáng)性判斷截域參考值（Cutoff）

1．5．2 統(tǒng)計(jì)單個(gè)指標(biāo)的陽(yáng)性檢出率，陽(yáng)性一致率、陰性一致率、總符合率。以四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果并對(duì)結(jié)果進(jìn)行四格表的kappa檢驗(yàn)以驗(yàn)證兩種試劑定性結(jié)果的一致性。

1．5．3 建立回歸方程并分析 用回歸分析驗(yàn)證兩種試劑結(jié)果的相關(guān)性，以y=a+bx和R2的形式給出回歸分析的擬合方程，其中：y是對(duì)照方法的試劑檢測(cè)結(jié)果，x是標(biāo)準(zhǔn)方法的試劑檢測(cè)結(jié)果，b是方程斜率，a是y軸截距，R2是判定系數(shù)，同時(shí)應(yīng)給出b的95%置信區(qū)間，定量值結(jié)果應(yīng)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2．1 兩種試劑盒測(cè)定結(jié)果 分別用對(duì)照試劑（蛋白芯片）與標(biāo)準(zhǔn)試劑（貝克曼/羅氏）對(duì)血清樣本進(jìn)行消 化 道 常 見 腫 瘤 標(biāo) 志 物 （CA19-9、AFP、CEA、CA724）測(cè)定，它們的檢測(cè)結(jié)果如表2所示：

表2 樣本類型分組測(cè)定結(jié)果

惡性腫瘤組消化道癌（包括食道癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、賁門癌、胃癌）、肝癌以及其它癌癥等。相關(guān)良性疾病組消化道器官疾病，包括腸梗阻、腸息肉、腸瘺、腸炎、胃炎等。

2．2 兩種方法檢測(cè)常見腫瘤的陽(yáng)性率 兩種試劑盒檢測(cè)常見腫瘤的陽(yáng)性率見表3。

表3 腫瘤組中常見腫瘤的陽(yáng)性率

2．3 兩種方法測(cè)定值常見腫瘤的陽(yáng)性率定性判定結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析表 4a，b，c，d。

2．4 以對(duì)照方法（考核試劑）作Y軸，標(biāo)準(zhǔn)方法（參比試劑）作X軸，作散布圖如下。從相關(guān)系數(shù)r和散點(diǎn)圖的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可看出，兩種產(chǎn)品的相關(guān)性較好。

表4a兩種方法定性判定結(jié)果統(tǒng)計(jì)-CA19-9

表4b兩種方法定性判定結(jié)果統(tǒng)計(jì)-AFP

表4c兩種方法定性判定結(jié)果統(tǒng)計(jì)-CEA

表4d兩種方法定性判定結(jié)果統(tǒng)計(jì)-CA724

4 討論

腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)已成為繼影像學(xué)和病理學(xué)診斷之后臨床最常用的腫瘤診斷方法，在腫瘤普查、診斷、判斷預(yù)后和轉(zhuǎn)歸以及評(píng)價(jià)療效等方面具有較高的實(shí)用價(jià)值。

采用放射免疫分析或化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測(cè)血清中的腫瘤標(biāo)志物，是高危人群篩查、腫瘤病人治療或預(yù)后評(píng)估的常用的檢測(cè)手段。近年來(lái)采用的蛋白芯片聯(lián)合檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物，具有樣本用量少[7]，檢測(cè)通量大的優(yōu)點(diǎn)，在高危人群的篩查中越來(lái)越受到關(guān)注。

蛋白芯片法的檢測(cè)原理是利用抗原抗體特異性結(jié)合后在固相基質(zhì)上結(jié)合腫瘤標(biāo)志物的抗體，捕獲被檢血清中對(duì)應(yīng)的腫瘤標(biāo)志物，再通過(guò)特定的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生光信號(hào)，檢測(cè)光信號(hào)從而檢測(cè)血清中的腫瘤標(biāo)志物[8]，具有微型化、高速度、高通量、高靈敏度等特點(diǎn)，其對(duì)腫瘤的早期診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)具有輔助作用[9]。盡管蛋白芯片檢測(cè)有諸多優(yōu)點(diǎn)，但蛋白芯片的應(yīng)用也有一定爭(zhēng)議，有研究者表示其與單個(gè)血清腫瘤標(biāo)志物比較存在一定的假陽(yáng)性[10]，分析其可能的原因可能是不同的抗體反應(yīng)需要的時(shí)間是不一樣的，而蛋白芯片法將多種抗體置于同一基質(zhì)片采用相同的時(shí)間反應(yīng)，會(huì)帶來(lái)結(jié)果的影響[11]。

腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)是診斷消化道惡性腫瘤的重要參考依據(jù)，對(duì)于消化道腫瘤的診治和預(yù)后判斷具有重大意義[12]，研究者們對(duì)腫瘤標(biāo)志物在消化道腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中廣泛關(guān)注[13]。然而單獨(dú)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物具有一定局限性，本研究目的是探討多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃消化道腫瘤的早期診斷價(jià)值和兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的可比性。對(duì)CEA的研究表明CEA在多種腫瘤患者血清中都可表現(xiàn)為升高，尤其是胃腸道腫瘤，并且較高血清CEA水平的胃癌有較高的轉(zhuǎn)移率[14-17]。CA724是目前公認(rèn)較好的胃癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物[18]，研究顯示CA724可作為胃癌轉(zhuǎn)移的一項(xiàng)敏感腫瘤標(biāo)志物[19]。CA199屬于血液循環(huán)的胃腸道腫瘤相關(guān)抗原[20]，在殘胃癌、無(wú)法手術(shù)切除的患者中陽(yáng)性率為64．9%[21]，聯(lián)合檢測(cè)有利于提高疾病診斷敏感性和特異性。本實(shí)驗(yàn)中我們對(duì)不同人群（包括惡性腫瘤組、良性疾病組和正常人群）的血清標(biāo)本采用蛋白芯片法和傳統(tǒng)的貝克曼化學(xué)發(fā)光法和羅氏電化學(xué)發(fā)光法單指標(biāo)腫瘤標(biāo)志物測(cè)定的結(jié)果作比較，探討蛋白芯片法在本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的可行性。研究結(jié)果顯示對(duì)照試劑（蛋白芯片）與標(biāo)準(zhǔn)試劑（貝克曼/羅氏）對(duì)血清樣本進(jìn)行消化道常見腫瘤標(biāo)志物 CA19-9、AFP、CEA、CA724測(cè)定具有高度的一致性性：CA19-9符合率93．55% ；AFP 符 合 率 99．04% ；CA724 符 合 率95．50%；CEA 符合率 100．00%。

本臨床研究中僅很少數(shù)樣本檢測(cè)結(jié)果存在差異。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)兩種方法測(cè)值存在差異的樣本進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn)，復(fù)測(cè)結(jié)果與原值部分不相符，對(duì)不符合的樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)測(cè)定值在參考值范圍的上限或下限附近，存在“灰區(qū)”效應(yīng)。因兩種方法正常值范圍不盡相同，而且可能存在人群、地區(qū)等的差異。

綜上所述，蛋白芯片法聯(lián)合檢測(cè)CA19-9、AFP、CEA、CA724與化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)單個(gè)腫瘤標(biāo)志物具有高度一致性，蛋白芯片法可用于消化道腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)，為臨床在消化道疾病的治療和預(yù)后上采取準(zhǔn)確的治療措施提供重要數(shù)據(jù)。

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