菜籽油低共熔溶劑萃取物DPPH自由基清除能力研究

毛立忠 倪勤學 高前欣 許光治 張有做

(浙江農林大學農業與食品科學學院；浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，臨安 311300)

菜籽油是我國的一種主要食用植物油，具有飽和脂肪酸低，油酸含量高，且亞油酸、亞麻酸含量合理[1]等特點，除了主要的甘油三酯以外，還含有甾醇、菜籽多酚、生育酚、磷脂、色素、游離脂肪酸等多種微量營養元素[2]。隨著生活水平的提高，人們對食品保健功能的要求越來越高。菜籽油中含有多種對人體有特殊生理作用的功能性成分，但菜籽油加工工藝的差別、原料產地等因素對功能成分的種類和含量有影響，需要以功能成分為指標建立菜籽油品質評價標準。另外，功能成分的作用機理也還需要進一步研究。這些都需要菜籽油功能成分萃取方法?，F在植物油多酚等功能成分的萃取主要以甲醇為萃取劑，但甲醇是易揮發、易燃、有毒的試劑并不是綠色萃取劑。

低共熔溶劑(Deep eutectic solvents ，DESs)是近年開始研究的一種新型的環境友好型離子溶劑，是由氫受體(季銨鹽類等)和氫受體(尿素、多羥基化合物等)組成的混合物，具有蒸汽壓低、無毒性、不易燃、可生物降解、溶解性和導電性優良、電化學穩定窗口寬等獨特的物理化學性質，并且可以通過選擇合適的組成和配比來調節其性能[3],近年來廣泛應用于化學相關的多個領域，包括無機材料的制備、有機合成、生物化學和分析化學[4]。隨著低共熔試劑的不斷開發，有越來越多的研究利用低共熔溶劑分離生物體中的活性成分，包括類黃酮[5]、兒茶素[6]、酚酸[7]、萜類化合物[8]和皂苷[9]。

本研究比較了3種低共熔溶劑(DES)和80%甲醇菜籽油萃取物的抗氧化活性，篩選出最佳萃取劑，并分析了抗氧化成分。以期為植物油微量營養物質的分析和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

菜籽油：市售壓榨菜籽毛油；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：Sigma公司；氯化膽堿、乙酰丙酸、尿素：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇(色譜純)：MS1922-001，美國TEDIA公司；福林酚：北京索萊寶科技有限公司；GF254硅膠板：青島海洋化工廠；甲醇、乙酸乙酯、甘油、正己烷：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

DK-8D電熱恒溫水槽：上海精宏實驗設備有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；1-14離心機：德國SIGMA；UV-1800紫外可見分光光度計、20AT高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 低共熔溶劑制備

用不同的氫供體來制備低共熔溶劑。將這些組分置于帶蓋的離心管中，在水浴中攪拌加熱至80 ℃，直至形成均勻穩定的無色透明液體[10]。制備的低共熔溶劑成分配比及其名稱縮寫如表1所示。

表1 低共熔溶劑的組成

1.2.2 低共熔溶劑萃取菜籽毛油抗氧化物質

將配好的低共熔溶劑于水浴鍋中加熱至60 ℃左右，以降低低共熔溶劑的黏度。取5 mL離心管，加入2 mL菜籽毛油，隨后加入1 mL相應的低共熔溶劑。充分振蕩后，在60 ℃超聲鍋(70 Hz)中超聲10 min,然后在60 ℃的水浴鍋中萃取1 h。在萃取期間，將混合物每隔15 min振蕩半分鐘。隨后將兩相混合物在5 000 r/min下離心10 min。通過注射器針頭扎破離心管，取出極性萃取物(下層相)。

1.2.3 甲醇/水(80∶20)采取菜籽毛油萃取抗氧化物質(對照樣品)

取5 mL離心管，加入2 mL菜籽毛油，隨后加入1 mL甲醇/水(80∶20)混合，將混合物充分振蕩后置于60 ℃超聲鍋(70 Hz)中超聲10 min，然后在60 ℃的水浴鍋中萃取1 h。在萃取期間，將混合物每隔15 min振蕩半分鐘。隨后將兩相混合物在5 000 r/min下離心10 min。通過注射器直接取出甲醇相(上層相)。

1.2.4 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力實驗參考Wang等[11]的方法。取20 μL萃取液加入3.9 mL DPPH(0.101 mmol/L)溶液中，搖勻避光靜置30 min。用甲醇對分光光度計調零，于517nm波長下測定吸光值，定為A。3.9 mL DPPH溶液和20 μL甲醇(樣品萃取、稀釋所用溶劑)為空白對照，測定值為A0，每組樣品平行測定3次，通過公式計算DPPH清除率。

清除率=(A0-A)/A0×100%

式中：A0為空白對照吸光值；A為樣品吸光值。

1.2.5 總酚含量的測定—Folin酚比色法

總酚的測定參考文獻[12]，標準曲線的制作：以沒食子酸為標準品，精確稱取沒5.0 mg,用少量蒸餾水溶解后并定容于50 mL。容量瓶中。取7支10 mL比色管，精確移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的沒食指酸標準溶液，各加入6 mL蒸餾水，搖勻后加入0.5 mL福林酚試劑，搖勻，1 min后各加入20%碳酸鈉溶液1.5 mL，搖勻定容至10 mL。75 ℃下反應10 min，765 nm波長下測定吸光值[13]。以吸光值為縱坐標，加入樣品濃度為橫坐標作線性回歸，得標準曲線：Y=1.5596X+0.0211，R2=0.998 8。

樣品測定：各取0.05 mL萃取物于10 mL比色管中，按上述方法測定樣品吸光值，重復3次，根據標準曲線計算相應的總酚含量。

1.2.6 薄層層析(TLC)初步鑒別

菜籽油提取物抗氧化物質TLC初步鑒定參考張志英[14]的方法，實驗中采用了GF254硅膠板作為固定相，正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇=9∶9∶2為流動相，0.2 mmol/L的DPPH溶液為抗氧化成分顯色劑(成分展開后，清除DPPH自由基能力強的部位顯示為白色斑點，反之顯示淡紫色)。

樣品處理：取5 mL離心管，加入DES-5與80%甲醇萃取物各0.1 mL，0.9 mL蒸餾水用于破壞低共熔體系，1 mL乙酸乙酯反萃。充分振蕩混勻后，在70 Hz水浴鍋中超聲10 min，隨后將混合物在5 000 r/min下離心10 min，得乙酸乙酯反萃液，重復2次實驗，隨后用毛細管將各乙酸乙酯反萃液在硅膠板上點樣分析。

1.2.7 HPLC分析條件

萃取物的抗氧化成分HPLC分析參考Liu等[15]的方法，分析柱為C-18柱(Inertsil ODS-SP, 4.6 mm×250 mm,內徑5 μm)，高效液相色譜系統為島津20AT。流動相：溶劑A為含0.1%乙酸酸化的去離子水，溶劑B為含0.1%乙酸的甲醇。上樣體積為10μL，流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃下。HPLC條件：0～10 min溶劑B濃度由10%升至30%，10～30 min溶劑B濃度由30%升至40%，40～50 min溶劑B濃度由40%升至60%，50～55 min溶劑B濃度為100%，55～65 min溶劑B濃度由100%降至10%，并以 10%濃度溶劑B保持到70 min運行完成。

2 結果與討論

2.1 不同低共熔溶劑菜籽油萃取物抗氧化活性比較

氫供體和氫受體的組成及比例決定了低共熔溶劑物理化學性質，影響了其對溶質的溶解能力[16]。本研究以氯化膽堿為低共熔溶劑的氫受體，以尿素、甘油和乙酰丙酸為氫供體，制備不同的低共熔溶劑，用于菜籽油中抗氧化物萃取。

首先以氯化膽堿∶氫供體比例為1∶2(DES-1、DES-2、DES-3)制備低共熔溶劑，萃取菜籽油中的抗氧化物質，以DPPH自由基清除能力為指標比較了不同溶劑萃取物的抗氧化能力，以80%甲醇萃取物為對照。結果如表2所示，DES-3萃取劑的萃取效果最佳，其萃取能力顯著強于80%甲醇萃取物，DPPH自由基清除率比80%甲醇萃取液高了27.29%。DES-1、DES-2從菜籽毛油中萃取抗氧化活性物質的能力顯著弱于80%甲醇溶液。

表2 不同溶劑的萃取物的DPPH自由基清除率

注：表中數據與各溶劑萃取物的“清除率平均值±標準差”(n=3)；表中同一列的不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2 氯化膽堿-乙酰丙酸摩爾比對低共熔溶劑萃取物抗氧化活性的影響

低共熔溶劑氫受體和氫供體摩爾比的不同對其熔點、密度、黏度、物理性質均有較大影響。低共熔溶劑的熔點與其陰陽離子的結構密切相關，陽離子對稱性的增加以及陰離子尺寸減小，組分間氫鍵的形成等因素將使其熔點顯著升高[17]，而氫鍵在低共熔溶劑組件分子之間的相互作用決定了它的高可萃取性和低熔點[18]。

為了研究氯化膽堿與乙酰丙酸不同摩爾比對所形成低共熔溶劑萃取菜籽毛油抗氧化活性物質的影響，根據摩爾比的不同配制了DES-3、DES-4、DES-5、DES-6、DES-7共5種低共熔溶劑，均按照1.2.2的步驟從菜籽毛油中萃取抗氧化活性物質，并比較了抗氧化活性。結果如表3所示，不同摩爾比形成的低共熔溶劑對于菜籽毛油中抗氧化活性成分的萃取無明顯差異。由此可見，氯化膽堿和乙酰丙酸的摩爾比的變化對于形成的低共熔溶劑在菜籽毛油中萃取抗氧化活性成分的能力影響不大。氯化膽堿和乙酰丙酸的摩爾比為1∶2時，溶液密度大、黏度高，密度大可以提高溶質的溶解能力但黏度大不利于傳質[16]，隨著乙酰丙酸的摩爾比增加溶液密度減小、黏度降低，這可能是導致不同低共熔溶劑萃取物抗氧化能力變化不大的原因。

表3 氯化膽堿與乙酰丙酸不同配比形成的低共熔溶劑的

2.3 萃取物中抗氧化活性成分初步鑒別

本研究顯示氯化膽堿-乙酰丙酸低共熔溶劑菜籽油萃取物的抗氧化能力顯著強于80%甲醇萃取物，這可能由于低共熔溶劑萃取率高于甲醇，或者萃取了更多的抗氧化物質，或兼而有之。為了查明2種萃取物抗氧化能力差異的原因，測定萃取物總酚的含量并用薄層層析-DPPH顯色實驗初步分析了抗氧化物質的差異。

菜籽毛油的氧化穩定性較好，與多酚類物質含量較高有關[19]。采用Folin酚比色法測定了萃取物總酚的含量，結果表明，菜籽毛油80%甲醇萃取物總酚含量(以沒食子酸計)為(1.210±0.046) mg/mL，而DES-5萃取物總酚含量(以沒食子酸計)為(1.734±0.028) mg/mL； DES-5萃取菜籽毛油總酚和80%甲醇相比具有很大的優勢，總酚比80%甲醇高了43.27%。

為比較兩種萃取物抗氧化物質種類的差異，采用薄層層析-DPPH顯色實驗進行了分析。低共熔溶劑不易揮發，因此萃取物無法直接用于薄層層析。低共熔溶劑是通過氫供體和受體之間通過氫鍵而形成的溶液，水可以破壞它們之間的氫鍵。因此，采用加9倍體積水破壞低共熔體系，然后用過乙酸乙酯萃取的方法來解決這個問題。通過這種方法，抗氧化物質的回收率超過92%。

圖1 80%甲醇與DES-5萃取物組分分離薄層層析圖

從圖1結果可知， 80%甲醇萃取物中的抗氧化成分為物質A與物質C，DES-5萃取物中含有物質A、物質B與物質C共3種成分。雖然80%甲醇萃取物中物質C的含量高于DES-5，但幾乎沒自由基清除能力較強的物質B，這是DES-5提取物自由基清除能力強于80%甲醇的原因之一。

2.4 HPLC結果分析

菜籽油中主要多酚類物質包括Canolol、芥子酸、阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸、丁香酸等。在菜籽毛油和冷榨菜籽油中，Canolol是最主要的菜籽多酚[19]。研究表明，Canolol最大吸收峰在275 nm處[20]，芥子酸的檢測波長為320 nm[21]，阿魏酸的檢測波長為316 nm[22]。為了比較全面分析萃取物多酚的種類和含量，確定275 nm和320 nm為檢測波長。

由圖2可知，在275 nm波長下，DES-5萃取物的種類明顯比80%甲醇萃取物多，化合物“4”、“5”、“7”僅存在于DES-5萃取物中，其中化合物“7”是DES-5萃取物中含量最高的物質。DES-5萃取物中“2”和 “3”等主要化合物的含量也高于80%甲醇萃取物。 Klara等[23]研究了菜籽油精煉過程中酚類物質的變化，發現在菜籽毛油中主要的酚類物質為Canolol，占總酚含量的85%。根據含量和出峰時間，推測化合物“6”很有可能是菜籽多酚Canolol。

圖2 80%甲醇、DES-5萃取物在275 nm處的HPLC色譜圖

圖3 80%甲醇、DES-5萃取物在320 nm處的HPLC色譜圖

以320 nm為檢測波長的結果由圖3可知，DES-5萃取物中化合物“c”的含量比80%甲醇萃取物高53%，化合物“d”的含量比80%甲醇萃取物高了17.6%。此外，化合物“f”、“g”這兩種物質僅存在于DES-5萃取物中。

菜籽油中的多酚主要由芥子酸及其衍生物組成。最近，Liu等[15]研究了10種油菜籽中可溶性和不可溶性酚類物質的概況與分布，確定順式芥子酸的保留時間為26.98 min，1,2-二芥子?；咸烟堑谋Ａ魰r間為40.11 min。本實驗中的HPLC檢測參考了Liu等[15]的方法，測得化合物“b”的保留時間為26.979 min，故推測化合物“b”可能是順式芥子酸；復合物“d”的保留時間為40.131 min，推測化合物“d”可能為1,2-二芥子酰基葡萄糖。

HPLC分析結果可知，DES-5萃取物中的抗氧化物質的種類與含量均顯著高于80%甲醇萃取物，且萃取物總主要的抗氧化成分可能是菜籽多酚Canolol，這與總酚含量測定、薄層層析結果基本一致。表明氯化膽堿-乙酰丙酸形成的低共熔溶劑提取菜籽毛油中微量營養素的能力顯著高于80%甲醇，在微營養元素的檢測與提取上具有替代80%甲醇的潛力。

3 結論

不同溶劑從菜籽毛油中萃取抗氧化活性成分的能力存在明顯差異，氯化膽堿-乙酰丙酸低共熔溶劑在所選的3種以氯化膽堿為氫供體的低共熔溶劑中表現出最好的萃取能力，萃取效果顯著優于其他2種低共熔溶劑，且氯化膽堿與乙酰丙酸摩爾比的變化對其形成低共熔溶劑萃取抗氧化物質能力的影響不顯著。

氯化膽堿-乙酰丙酸低共熔溶劑與80%甲醇在菜籽毛油萃取液上相比，DPPH自由基清除率高了27.29%，總酚萃取效果提升了43.27%，薄層層析多出了一個明顯的抗氧化條帶。氯化膽堿-乙酰丙酸低共熔溶劑萃取物中多酚類物質的種類與數量都明顯多于80%甲醇萃取物。因此，該溶劑在植物油脂抗氧化成分的萃取和分析中可用于替代甲醇。

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