生物質材料與營養物配施對石油污染土壤的修復

王艷杰 ，李法云 *，榮湘民 ，陳佳勃 ，石麗芳

（1.湖南農業大學資源環境學院，長沙 410128；2.遼寧石油化工大學生態環境研究院，遼寧 撫順 113001）

石油和石油產品在生產、運輸等過程中進入土壤環境，會導致土壤質量下降，影響土壤的繼續使用[1]。為了降低石油烴進入土壤中所引起的環境風險，生物修復作為一種環境友好型技術得到廣泛應用[2]。在環境條件（例如，溫度、土壤水分、氧氣和營養物等）比較適合的情況下，生物修復方法能夠較好地去除土壤中的石油烴。土壤中石油烴的去除可以依靠自然的微生物群落，為了在生物修復過程中達到效率最大化，通常采用生物刺激的方式，在土壤中添加營養物、膨松劑、物質碎屑、生物炭等材料來刺激土著微生物群落的生長和繁殖[3－4]。原油進入土壤中會影響土壤的物理性質，破壞土壤結構，導致土壤緊實、容重增大、孔隙度降低，同時，原油污染也會導致土壤碳氮比失衡，氮元素缺乏會阻礙碳的利用，影響微生物生長[5－6]。在修復過程中，土壤理化性質的變化可用于衡量土壤可利用性和土壤的健康狀況。不同類型的疏松材料添加到土壤中能夠改善土壤質量，增加土壤孔隙度，提高土壤通氣性和保水、保肥能力[7]。通過添加限制性元素調節土壤中營養物的比例既能夠促進微生物群落的活性，又能提高石油烴的生物降解率[8－9]。

石油污染土壤的生物修復受多種因素的影響，目前關于石油污染土壤生物修復的研究多集中在菌種添加、土壤微生物群落變化、石油烴降解效果和影響機制等方面[10－12]，在土壤物理性質、化學性質和微生物特征的變化對石油污染土壤修復效果的影響方面研究較少，尤其是關于土壤容重、孔隙度和水分條件等物理性質對石油污染土壤的養分、微生物特征和石油烴降解效果的直接或間接影響。本文利用營養物質添加以及土壤疏松材料的配施來改善石油污染土壤性狀，主要研究營養物質（氮、磷）、玉米秸稈碎屑和生物炭對石油污染土壤理化性質、生物特征和石油烴去除率的影響，通過相關性分析闡明土壤理化指標、微生物特征及石油烴去除率之間的關系。研究添加疏松材料后土壤物理性質的變化對營養物利用率及微生物特征的影響，并進一步分析不同處理方式下污染土壤的修復效果，以期為石油污染土壤的修復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

石油污染土壤樣品采集于遼河油田作業區，采集的土壤經過陰干、碾碎，過2mm篩后備用。石油污染土壤總石油烴濃度為 9.53 g·kg－1，飽和烴、芳香烴和非烴類物質的濃度分別為 5.26、1.65 g·kg－1和2.62 g·kg－1。

1.2 試驗材料制備

采集東北地區常見的玉米秸稈作為試驗材料，將表面葉去掉，秸稈截成段后在60℃條件下烘干24 h，然后粉碎得到玉米秸稈碎屑。將粉碎后的玉米秸稈碎屑在300℃缺氧裂解3 h得到玉米秸稈生物炭。

1.3 試驗設計

共設置4個不同處理，T1為對照處理組，石油污染土壤中石油烴自然衰減；T2為營養物添加處理組，研究在僅添加營養物條件下石油烴的減少情況，營養物為NH4NO3和K2HPO4，調節土壤碳/氮/磷比為100/10/1，在0 d和修復45 d時添加營養物；T3為玉米秸稈碎屑與營養物質聯合處理組，玉米秸稈碎屑添加比例為5%，營養物質添加比例和時間與T2相同；T4為玉米秸稈生物炭與營養物質聯合處理組，玉米秸稈生物炭添加比例為5%，營養物質添加比例和時間與T2相同。試驗土壤和材料裝入培養盆（21 cm×21 cm×15 cm）中在培養箱內進行培養，保持土壤濕度為土壤持水量的60%并定期翻攪，每個處理設置3個重復。修復時間為90 d，每10 d測定總石油烴及不同組分烴類物質變化。修復時間為30、60 d和90 d時分別測定各處理組微生物數量。修復結束后測定土壤容重、土壤孔隙度、田間持水量、土壤總氮、總磷。

1.4 測定與分析方法

總石油烴的測定是用30 mL二氯甲烷于10 g風干土樣中在 60 W 下超聲萃取 15 min，4000 r·min－1離心10 min后將上清液倒出至已恒重的燒瓶中，重復3次，提取后的上清液54℃蒸發至干，用重量法測定。將蒸發后得到的總石油烴用正己烷溶解，進行層析分離，所用層析柱為10 mm×60 mm的硅膠氧化鋁層析柱，將活化后的填充物采用濕法裝柱，自下而上依次為1 cm無水硫酸鈉、12 cm活性硅膠、6 cm活性氧化鋁和1 cm無水硫酸鈉，分別用20 mL正己烷、50 mL二氯甲烷/正己烷（體積比1∶1）和50 mL甲醇洗脫飽和烴、芳香烴和非烴類物質，重量法測定[13]。土壤理化性質測定參照《土壤農業化學分析方法》，土壤容重、土壤孔隙度和田間持水量采用環刀法測定，土壤總氮和總磷分別采用凱氏法和碳酸鈉熔融法測定[14]。土壤中微生物數量采用稀釋平板法測定，取10 g土壤于無菌水中依次稀釋成10－1～10－7稀釋液，對號放入無菌培養皿中加入培養基，在37℃恒溫培養箱中培養48 h，計算微生物數量，結果表示為每克干土中的菌落形成單位CFU（Colony－FormingUnits）。試驗結果采用SPSS進行方差分析、差異性檢驗和相關性分析。

2 結果與討論

2.1 修復前后土壤理化性質比較

土壤容重和土壤孔隙度是表示土壤物理特征的重要指標，能夠反映土壤的緊實度，對土壤水、肥、氣、熱等狀況產生影響，同時影響土壤中微生物活性和植物的生長[15]。不同處理組修復后土壤容重和土壤孔隙度見表1。修復初期土壤容重1.481 g·cm－3，修復后各處理組土壤容重均有所降低，與修復初期相比呈顯著性差異。修復初期土壤孔隙度為39.507%，修復后T1和T2處理組土壤孔隙度變化較小，與修復初期相比差異不顯著，T3和T4處理組土壤孔隙度明顯增加（P＜0.05）。與對照組相比，添加玉米秸稈碎屑和生物炭能夠有效調節土壤容重和孔隙度，單因素方差分析及LSD多重比較結果表明，不同處理組除T1與T2、T3與T4之間容重和土壤孔隙度無顯著性差異（P＞0.05）外，其他各組分之間均呈顯著性差異（P＜0.05）。田間持水量是影響土壤質量的重要因素，能夠表征土壤的蓄水能力，為生物生存和生長提供必要的環境條件。修復初期土壤田間持水量為12.137%，修復后不同處理組的田間持水量差異明顯，與修復初期相比，對照組田間持水量變化較小，其他3個處理組土壤田間持水量明顯提高（P＜0.05），增量 1.173%～9.903%，其中添加玉米秸稈碎屑和生物炭對改善土壤持水量有顯著性作用。單獨添加營養物質處理組對土壤容重、孔隙度和田間持水量影響較小，添加玉米秸稈碎屑、生物炭以及配合施用營養物質對上述三個指標影響明顯，說明玉米秸稈碎屑和生物炭能夠有效調節土壤土壤物理性質。相關研究表明添加秸稈、生物炭等材料，有利于降低土壤容重，增加土壤孔隙度，提高土壤保水能力，尤其是生物炭材料，物理結構方面孔隙結構多，且表面官能團豐富，加入到土壤中能夠改善土壤物理性質并提高土壤肥力[15－19]。

修復初期總氮和總磷分別為 0.436 g·kg－1和0.048 g·kg－1，污染土壤修復后氮、磷含量與初期相比均有所提高，除對照組外，其他處理組總氮含量變化呈顯著性差異（P＜0.05），修復后對照組總磷含量和初期相比變化較小，其他處理組均顯著增加（P＜0.05），其中T2與T3兩組無顯著性差異。添加玉米秸稈碎屑和生物炭能夠吸附添加到土壤中的營養物質，提高氮、磷營養物質的利用效率，尤其是生物炭處理組，因其疏松多孔的結構特征，更有利于營養物質的吸收和貯存，因而其營養物質利用效率更高[18，20]。在石油污染土壤的生物修復中，氮、磷是無機營養物中的限制性因素。因為碳的大量輸入導致石油污染土壤碳氮比、碳磷比失衡，進而影響微生物活性，在石油烴降解過程中，因微生物代謝需要所消耗的礦質營養物質增加。氮磷肥料的添加能夠增強石油污染土壤修復效果[21]。

表1 修復后不同處理組土壤理化性質Table1 Physicochemical characteristics of the bioremediated soil after the treatments

2.2 不同處理對土壤微生物的影響

土壤微生物是土壤生物化學過程的重要參與者，影響土壤中營養物質的利用、有機物的轉化與降解。石油污染土壤因其理化性質受到影響，土壤板結、孔隙度降低，土壤碳氮比失衡，土壤中微生物生存受到限制，致使微生物數量較低。本研究中利用添加營養物質、玉米秸稈碎屑和生物炭來改善土壤環境，為微生物生存提供有利條件。修復初期微生物數量為2.24×104CFU·g－1，修復 30、60 d 和 90 d 時土壤中微生物數量表現出不同程度的變化（圖1）。修復30 d時，與修復初期相比，微生物數量變化較小，僅生物炭與營養物聯合處理組微生物數量增加。修復處理60 d時，除對照組外其他各處理組微生物數量與修復初期相比均有所增加，其中T3和T4處理組增幅較大，增加到 3.72×105CFU·g－1和 4.20×106CFU·g－1。修復結束后，T4 處理組微生物數量達到 7.24×107CFU·g－1，與其他處理組及該處理組修復30 d和60 d的微生物數量相比，顯著增加；其次為T3處理組，微生物數量達到6.03×106CFU·g－1。微生物數量的增長幅度在修復60～90 d范圍內低于30～60 d的微生物增長幅度。T3和T4處理組微生物與對照組和單獨添加營養物處理組相比，數量顯著增加，表明玉米秸稈碎屑和生物炭添加能為土壤微生物的生存和繁殖提供環境，尤其是生物炭處理組，其孔隙結構內外能夠吸附更多的營養物，且生物炭表面官能團豐富，刺激微生物生長，更有利于微生物的存活與繁殖[7，22－24]。Kumari等[25]研究表明添加調理劑能夠為微生物提供營養、水分、空氣和物理環境的支持，為石油污染土壤中微生物群落及生物量增加提供條件。

圖1 不同修復期土壤微生物數量Figure1 The total bacterial numbers during different remediated period

圖2 不同修復期總石油烴去除率Figure2 Removal rate of the TPH in the soil during different remediated period

2.3 不同修復方式下污染土壤總石油烴及不同組分石油烴的變化

通過添加營養物質、玉米秸稈碎屑和生物炭來改善土壤性質，減少土壤中的石油烴含量。總石油烴去除率隨修復時間延長呈增長趨勢，在修復后期石油類物質去除速率明顯減小（圖2）。經過90 d的修復周期，不同處理組（T2～T4）的總石油烴濃度由修復初期的 9.53 g·kg－1降低到 4.74～6.91 g·kg－1，總石油烴去除率為27.44%～50.30%，顯著高于對照組的石油烴去除率16.15%（P＜0.05）。不同處理組間，石油烴類物質的去除率表現為T4、T3、T2、T1依次降低的趨勢，其中單獨添加營養物處理組石油烴類物質的去除率明顯低于玉米秸稈碎屑和生物炭與營養物質聯合處理組。添加營養物質可提高石油烴去除率11.29%，再添加土壤疏松材料可提高石油烴去除率26.07%～34.15%。通過營養物質的添加，調節土壤中營養物的含量，有助于增加微生物生物量。適宜的營養物比例，如碳氮比，是石油烴物質快速降解的必要條件。土壤疏松材料的添加為微生物群落提供棲息場所、空氣、水分等生存條件，進而提高石油烴物質的去除率[26]。

不同組分石油烴物質呈現出不同的降解規律，其中飽和烴類物質的去除率較高，芳香烴去除率低于飽和烴，非烴類物質的去除率最低。修復初期污染土壤中飽和烴濃度為5.26 g·kg－1，修復后T3和T4處理組飽和烴濃度降低較多，分別降低至2.55 g·kg－1和1.97 g·kg－1。與對照組相比，其他處理組的飽和烴去除率呈顯著性差異，修復后去除率最高達62.47%，出現在生物炭與營養物質聯合處理組，其次為玉米秸稈碎屑與營養物聯合處理組（51.43%），分別比對照組增加41.16%和30.12%（圖3a）。兩種處理在修復20～60 d，飽和烴去除率增加趨勢明顯，60 d以后，增長趨勢平緩，主要是由于飽和烴易于被微生物利用，在不同組分石油烴物質中優先得到降解，因此，在修復前期去除效率明顯高于修復后期。修復30～60 d內，微生物數量增幅明顯，有助于提高石油烴物質的去除效率。修復后不同處理組芳香烴濃度由修復初期的1.65 g·kg－1降低為 0.93～1.43 g·kg－1。不同處理組芳香烴去除率范圍為13.10%～43.89%（圖3b），生物炭與營養物質聯合處理組效果最佳，其次為玉米秸稈碎屑與營養物質聯合處理組，各處理組間芳香烴去除率差異顯著（P＜0.05）。T3和T4在修復40～70 d內芳香烴的去除率增長較快，在修復初期和后期去除率變化較小。不同處理組非烴類物質的去除率均較低，經計算去除率最高僅為20.71%，出現在T4處理組，修復后非烴類物質濃度由初始的 2.62 g·kg－1下降到 2.08 g·kg－1（圖3c），該類物質多滯留在土壤中，對土壤微生物活性造成影響，也是最難降解的石油烴類物質[27]。通過添加蓬松材料增加土壤中氧氣的流通，能夠增強土壤中微生物的代謝活動，有利于非烴類物質的去除。本研究中T4和T3處理組添加了生物炭和玉米秸稈碎屑，其處理效果優于未添加疏松材料的T2處理組。與T1相比，T2的非烴類去除率無顯著性差異，僅添加營養物質并不能有效去除非烴類物質。

對照組在修復后不同組分石油烴去除率也有一定程度的增加，在修復過程中提供的光照、溫度和定期翻耕有利于改善土壤性質以及提高微生物活性。通過定期添加營養物質能夠提高土壤肥力，有利于增加土壤中微生物的數量，從而提高石油烴降解率。由于石油污染土壤緊實度高，單獨添加營養物質不易于在土壤中存留，流失較多，因而T2處理組的總石油烴和不同組分烴類物質的去除效率與對照組相比，增加幅度較小。T3和T4處理組除添加營養物質以外，還施用了玉米秸稈碎屑和生物炭，尤其是生物炭，增加土壤孔隙度，增強土壤中氧氣的擴散，為微生物提供更加充足的氧氣，在改善土壤結構等特征的同時提高了土壤保水保肥能力，也為微生物的生存提供空間和物質基礎，微生物數量明顯增加，從而顯著提高修復效果[4，28]。與物質碎屑相比，同種物質的生物炭具有孔隙結構多、比表面積大等優勢，有利于土壤中空氣和水分的流通，且在土壤中穩定性和吸附性較強，能夠貯存加入到土壤中的營養物，為微生物生存和繁殖提供棲息環境和能量，增強微生物活性，有利于土壤中石油烴的降解[29－30]。

相關研究也表明添加麥稈、木屑等調理劑能夠改善土壤結構的穩定性和通氣性，強化對微生物群落的影響，進而提高石油烴降解效率[3]。試驗中定期翻耕一方面有利于增加土壤通氣性，另一方面能夠使土壤中石油烴物質重新分布、增大生物可接觸面積，提高石油烴物質的生物可利用性。營養物刺激、添加調理劑等方式對土壤中飽和烴和低碳數烴類物質的去除有積極作用，對高碳數、多環芳烴，尤其是非烴類物質作用不顯著，由于新陳代謝中間產物的積累和轉化，有可能出現修復過程中該類物質暫時增加的現象[31－32]。

圖3 不同修復期飽和烴（a）、芳香烴（b）和非烴類物質（c）去除率Figure3 Removal rates of saturated hydrocarbon（a），aromatic hydrocarbon（b）and non－hydrocarbon（c）in the soil during different remediated period

表2 修復后石油污染土壤特征與石油烴去除率相關性分析Table2 Correlation analysis between characteristics of the bioremediated soil and removal rate of petroleum hydrocarbon

2.4 石油污染土壤特征與石油烴去除率相關性分析

修復90 d后，對土壤理化性質和生物特征與修復初期相比的變化程度以及土壤中石油烴去除率的變化進行相關性分析（表2）。土壤物理特征指標容重、土壤孔隙度、田間持水量與總石油烴、飽和烴、芳香烴和非烴類物質去除率之間呈顯著相關（P＜0.05）。微生物數量與土壤孔隙度相關性極顯著，相關系數為0.991（P＜0.01），與其他兩個土壤物理指標相關性顯著，說明土壤孔隙度對石油污染土壤中微生物的生存影響較大，通過改善土壤孔隙度能夠增加土壤中微生物的數量[33]。土壤化學性質中總氮與總石油烴、芳香烴相關關系極顯著，相關系數分別為0.999和0.996（P＜0.01），總氮與飽和烴、非烴類呈顯著相關關系，土壤中加入氮營養物，能夠有效提高土壤石油烴的去除效果?？偟c土壤微生物數量相關系數達0.993（P＜0.01），研究表明，在土壤中加入氮營養物能夠有效提高微生物數量，進而促進石油烴物質的降解?？偭着c石油烴類和微生物的相關性小于總氮，總磷與總石油烴、芳香烴和微生物數量呈顯著相關（P＜0.05），添加總磷能在一定程度上提高微生物活性和促進石油污染土壤的修復效果。微生物數量與總石油烴及不同組分烴類之間相關性均非常顯著（P＜0.01），說明微生物數量越多，越有利于土壤中石油烴類物質的降解。相關研究表明缺乏氮、磷等營養物質會成為石油烴降解的限制性因素，補充適量的氮、磷營養物質能夠提高石油烴降解效果[34]。土壤微生物和土壤酶活性影響石油烴的代謝和降解，通過增強微生物和酶活性能夠降低土壤中石油烴含量[35]。添加調理劑有助于提供必要的營養物質，刺激石油污染土壤中土著微生物的生長，微生物群落豐富度和生物量增大，能夠提高石油烴的降解范圍和降解程度[31]。

3 結論

（1）添加玉米秸稈碎屑和生物炭能夠有效改善土壤容重、孔隙度和田間持水量，與營養物配施可提高營養物質在土壤中的截留比例、停留時間和利用效率，生物炭聯合處理組效果更佳。

（2）單獨添加營養物、物質碎屑和生物炭與營養物配施，均可提高土壤中微生物數量，其中生物炭聯合處理組修復后微生物數量增長最多。

（3）修復后各處理組總石油烴和不同組分烴類物質整體呈下降趨勢，生物炭聯合處理組效果最佳，其次為玉米秸稈碎屑聯合處理組。不同處理組中飽和烴、芳香烴和非烴類物質去除率依次降低。

（4）土壤理化性質與石油烴類物質去除率顯著相關，土壤孔隙度和總氮對微生物數量影響較大，微生物能夠明顯影響土壤中石油烴類物質的去除。因此，可通過改善土壤孔隙度及營養配比等理化特征提高土壤微生物數量，進而增強石油污染土壤修復效果。

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