發酵蜣螂粉乙醇提取物抗腫瘤活性研究

曹廣超,王彥多,劉 穎,李亞男,劉金虎,桑 曉,毛會秀,王集會,史 磊*

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2.山東中醫藥大學實驗中心，山東 濟南 250355)

蜣螂是鞘翅目金龜子科昆蟲屎殼螂Catharsius molssus L.的干燥全蟲[1]，在我國藥用歷史悠久，蜣螂作為傳統中藥材，其體內含有蜣螂毒素，能破癥結，通二便，定驚癇﹑拔毒生肌﹑散腫止血[2]。臨床上在治療小兒厭食癥，粘連性腸梗阻，輸尿管結石，肝硬化腹水方面臨床效果稱奇[3]?，F在藥理學對蜣螂的研究，主要集中于抗前列腺炎、抗前列腺增生以及抗炎等的方面[4-6]，而在其療效好抗腫瘤方面的研究相對較少。僅在黃顯章等對蜣螂的醇提取物進行人體肝癌細胞實驗的研究中發現，蜣螂對肝癌的抑制作用有顯著的效果[7]。

本次實驗，我們采用優化后的提取工藝提取發酵蜣螂醇提物，旋蒸后得發酵蜣螂的乙醇提取物，選擇有代表性的腫瘤細胞如乳腺癌細胞(MCF-7)、肺腺癌細胞(A549)進行體外抗腫瘤活性評價。為蜣螂在臨床上的應用及發現新的抗腫瘤藥物提供新的研究思路。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

UV9100B型紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)；ST 16R高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；HH-4數顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司)；DLSB-ZC低溫循環真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；FA1004N電子天平(上海精密科學儀器有限公司);六兩裝高速萬能粉碎機(浙江屹立工貿有限公司);遠紅外輻射干燥箱(上海陽光實驗儀器有限公司)；EL340i型全自動酶標儀(Molecular Davices);Memmert CO2培養箱(北京五洲東方科技發展有限公司)。

1.2 試劑

蕓香葉苷 三水(國藥集團化學試劑有限公司，批號:20170426);RPMI-1640培養基、胰酶(上海碧云天生物技術有限公司)；胎牛血清(賽默飛世爾生物制品北京有限公司)；MTT。

1.3 供試品

藥材蜣螂購自安徽省亳州市中藥材市場, 經山東中醫藥大學周鳳琴教授鑒定為蜣螂蟲Catharsius molossus L.的干燥體(批號：20170502)。

1.4 實驗細胞

肺腺癌A549細胞株、乳腺癌MCF-7細胞株均由山東省立醫院提供。

2 方法

2.1 藥材前期處理

將蜣螂經清水漂洗后瀝干，放入冷凍室冷凍后勻漿，在冷阱-60℃，室溫真空狀態下冷凍干燥至粉末狀，得蜣螂凍干粉。

2.2 發酵蜣螂粉的制備[8]

稱取適量的蜣螂凍干粉，按1∶1比例加入活的白僵菌孢子粉(100億/g，山東省農業科學院自篩菌株-桃5)，再加入少量吐溫-80，用適量滅菌水將其稀釋成1×108的混懸液，攪拌均勻后，轉移至恒溫恒濕培養箱中，在溫度為25～28 ℃，濕度為95 %的條件下發酵8h左右，直到長滿菌絲后便停止發酵，將其取出冷凍保存，以作備用。

2.3 發酵蜣螂乙醇提取物的制備[9]

稱取蜣螂凍干粉1.0000 g，加入圓底燒瓶中，按料液比1∶20加入80%的乙醇，在90℃條件下，乙醇回流提取兩次共2.5 h，抽濾后3000 r/min下離心10 min，最后將上清液(發酵蜣螂乙醇提取液)置旋轉蒸發儀中減壓回收乙醇, 即得蜣螂乙醇提取物。取出裝袋冷凍保存備用。

2.4 發酵蜣螂醇提物抗腫瘤活性研究

2.4.1 發酵蜣螂乙醇提物溶液的配制

精密稱取10 mg發酵蜣螂乙醇提物，溶于5 mL 1640培養液中，配成2 mg/mL溶液。在超凈工作臺中用0.22 μm的濾膜進行過濾，然后用已濾菌的1640培養基依次稀釋，配成1.6、1.2、0.8、0.4mg/mL濃度梯度的藥物溶液。

2.4.2 抗腫瘤活性實驗方法

將處于對數生長期的乳腺癌MFC-7細胞和肺腺癌A549，以每孔100 μL接種于96孔培養板，預留三個調零孔(調零孔只加不含血清的1640培養基，不加細胞)置于37℃、5% CO2培養箱中培養。待96孔板中的細胞長滿單層后，棄掉培養基，調零組和空白對照組加100 μL的1640培養基(不含血清)，陽性對照組加100 μg/mL的順鉑100μL，其他給藥組每孔分別加入不同濃度的藥物100 μL，每個濃度的藥物重復5個孔，其中以發酵蜣螂醇提液作為對照組。然后繼續在37 ℃、5 % CO2培養箱中培養。24 h后，每孔加入5 mg/Ml MTT溶液20 μL于培養箱內避光反應4 h。吸去上清液，加入100 μL DMSO，用酶標儀于492 nm處測定吸光度值，然后按下式進行藥物對細胞的抑制率的計算。

細胞抑制率(%)=[1-(加藥組OD-調零組)/(空白組OD-調零組)]×100 %

3 結果

3.1 MTT法測定發酵蜣螂乙醇提取物抗腫瘤活性

采用MTT法檢測不同濃度梯度下發酵蜣螂乙醇提取物對肺腺癌細胞A549、乳腺癌細胞MFC-7的抑制作用如表1所示。

組別A549細胞MCF-7細胞A492抑制率/%A492抑制率/%陰性對照0．361+0．001-0．317+0．001-發酵蜣螂乙醇提取物/(mg·L-1)0．40．250+0．00137．940．301+0．0016．210．80．263+0．00133．310．287+0．002b11．471．20．216+0．00149．580．220+0．00138．021．60．160+0．002a68．820．217+0．00139．122．00．146+0．002b73．730．111+0．00180．75

與陰性對照組比較，a：P<0.05，b:P<0.01。

為方便將不同濃度梯度下發酵蜣螂乙醇提取物對肺腺癌細胞A549、乳腺癌細胞MFC-7的抑制作用進行顯著比較及趨勢分析，列數據抑制率曲線如圖1所示。橫坐標為不同藥物的濃度(mg/mL)，縱坐標為醇提液對A549和MCF-7的抑制率(%)。

圖1 發酵蜣螂乙醇提取物對肺腺癌細胞A549、乳腺癌細胞MFC-7的抑制率
Fig.1 Inhibition ratio of the fermented Catharsius powders alcohol extracts on lung adenocarcinoma A549 and breast cancer MFC-7 cell

由圖1可知，不同藥物濃度對乳腺癌MCF-7和肺腺癌A549細胞具有較好的抑制作用，其IC50分別為1.51和0.94 mg/mL。隨藥物濃度的增加，對乳腺癌MCF-7細胞的抑制率成梯度性上升，且在藥物濃度小于1.6 mg/mL，其抑制效果不太顯著；當藥物濃度低于1.2 mg/mL時，對肺腺癌A549細胞的抑制率較弱，其后抑制效果隨濃度的增加而增大?？傮w來說，在藥物濃度低于1.6 mg/mL時，藥物對肺腺癌細胞的抑制率比對乳腺癌細胞的作用強，但作用強度較小。當藥物濃度超過1.6mg/mL時，對肺腺癌A549細胞和乳腺癌MCF-7具有很強的抑制效果，且作用強度后者大于前者。

4 討論

蟲類中藥的發酵，在國內外研究報道鮮少，采用新型固態發酵技術對傳統中藥進行成分提取，也是對蟲類中藥研究的的重大變革。中藥炮制就運用天然微生物發酵傳統中藥，有的可以提高中藥藥效，改變藥性及降低毒副作用等效應。本次研究中使用球孢白僵菌對蜣螂粉進行真菌發酵,研究經發酵后蜣螂醇提物的藥理活性，以期為蜣螂抗腫瘤新藥物成分的提取，提供新的方法，其次也增強藥物治療效果。在發酵蟲類中藥的研究中，具有一定的前瞻性。

體外藥理實驗結果表明：通過采用新型固體發酵方式，有利于提高蜣螂有效成分的提出率。再經乙醇回流提取后，對肺腺癌A549細胞和乳腺癌MCF-7具有不同的抑制效果。低濃度時，抗腫瘤抑制效果較弱；當提高藥物濃度，有利于藥物通過被動轉運進入細胞，使腫瘤細胞增殖受到抑制或產生細胞周期阻抑，進而達到抗腫瘤抑制效果。總體本次研究表明：發酵蜣螂醇提物對MCF-7和A549具有較好的抑制作用,且作用強度與藥物濃度成正比。其次為體內蜣螂抗腫瘤藥理實驗的研究提供指導，有利于開發新的抗腫瘤藥物為臨床用藥提供新思路。

[1] 南京中醫藥大學.中藥大辭典[M].2版.上海:上?？茖W技術出版社,2006．

[2] 侯仙明,張書金,賈云芳,等.蜣螂古今應用研究[J].河北中醫藥學報,2014(2):42-44.

[3] 陳建軍,劉立春.兩種藥用蜣螂蟲的人工飼養及誘捕技術[J].南京農專學報,2001(4):44-48.

[4] Ahn M Y，Hahn B S，Ryu K S,et al.Purification and characterization of a serine protease: (CPM-2) with fbrinolytic activity from thedung beetles[J].Arch Pharm Res,2005,28(7):816-822．

[5] 趙興梅,朱 敏,楊 明,等.蜣螂抗實驗性前列腺增生作用研究[J].中藥藥理與臨床,2006(5):37-38.

[6] 劉純益.關于昆蟲抗癌物質的研究概況[J].昆蟲知識,1979(4):182

[7] 黃顯章,丁生晨,袁 林,王 旭,郝鵬飛,張景景.蜣螂水提取物的鎮痛抗炎作用[J].中華中醫藥學刊,2016(09):2191-2194.

[8] 焦方文,張盼盼,孫 靜,等. 全蝎蛋白的超聲提取工藝研究[J/OL]. 山東中醫雜志,2016,35(09):824-825.

[9] 黃顯章,丁生晨,袁 林,等. 蜣螂乙醇提取物的抗炎作用研究[J].中華中醫藥學刊,2017(4)：1002-1004.

(本文文獻格式：曹廣超,王彥多,劉穎，等.發酵蜣螂粉乙醇提取物抗腫瘤活性研究[J].山東化工，2018，47(02)：22-24.)