高效液相色譜法同時測定飲料中6種合成著色劑

◎ 張 卉

（1.天津科技大學，天津 300457；2.天津市濱海新區漢沽產品質量監督檢驗所，天津 300480）

食品安全問題已經成為社會關注的熱點，合成著色劑性質相對穩定、環境變化對于其影響很小、不易褪色、價格相對低廉[1]，在食品工業中有著非常廣泛的應用，但過量攝入存在嚴重的安全隱患，我國對合成著色劑的使用范圍和使用量有嚴格的規定[2]。因此，食品中合成著色劑的檢測顯得尤為重要。本文建立了同時檢測飲料6種合成著色劑的高效液相色譜方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：日本島津LC-10ATVP高效液相色譜儀，配紫外檢測器、二極管陣列檢測器，色譜柱WondaSil C185 μm 4.6 mm×250 mm，KQ-50B超聲波清洗器，RE-52A旋轉蒸發器，SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵。

主要試劑：新紅標準溶液（1.000 mg/mL），北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司。檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍標準溶液（0.500 mg/mL），中國計量科學研究院。甲醇（色譜純），乙酸銨、檸檬酸、冰乙酸、甲酸、無水乙醇、氨水、聚酰胺粉（尼龍6），均為分析純。

1.2 試劑及標準溶液配制

①乙酸銨溶液（0.02 mol/L）：稱取1.54 g乙酸銨，加水溶解，于1 000 mL容量瓶中定容，用冰乙酸調pH=4，經0.45 μm微孔濾膜過濾，經超聲波清洗器超聲排氣泡。甲醇-甲酸溶液（6+4）。無水乙醇-氨水-水溶液（7+2+1）。②合成著色劑的混合標準溶液配制：用移液器準確吸取檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍標準品各1.0 mL，以及新紅標準品0.5 mL，用pH 6的水溶解定容至10 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾，配制成每毫升相當50 μg的合成著色劑。

1.3 樣品前處理

碳酸飲料：超聲驅除二氧化碳。

聚酰胺吸附法：稱取5 g（精確至0.001 g）樣品于小燒杯中，用檸檬酸調節溶液pH=6，將小燒杯放入水浴鍋中加熱至60 ℃，加1 g聚酰胺粉攪拌均勻成粥狀，無顆粒，用60 ℃ pH 4的水將樣品轉移至G3垂融漏斗中，然后用甲醇+甲酸（6+4）混合溶液洗滌3～5次，再用水洗至中性，用乙醇+氨水+水（7+2+1）混合溶液解吸3～5次，每次5 mL，收集解吸液于蒸發瓶中，將蒸發瓶置于旋轉蒸發器中，調節蒸發溫度60 ℃，蒸發至干，用移液器準確加入5.0 mL pH 6的水定容，經0.45 μm微孔濾膜過濾后，供高效液相色譜儀分析。

1.4 色譜條件

采用WondaSil C185 μm 4.6 mm×250 mm色譜柱，紫外檢測器，乙酸銨（0.02 mol/L，pH=4）-甲醇溶液作為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃。梯度洗脫程序：0～2 min甲醇從20%到50%，2～5 min甲醇從50%到100%，5～10 min甲醇保持100%，10.1～18 min甲醇保持20%。

2 結果與分析

2.1 變波長檢測程序優化

大多數物質在波長254 nm條件下都有較好的吸收能力，因此樣品中的雜質峰通常會影響對組分的判斷，而可變波長檢測能使我們需要的物質在其最大吸收波長處獲得高效色譜峰，減少雜質組分的干擾。

通過二極管陣列檢測器全波長掃描，確定6種合成著色劑的最大吸收波長分別是：新紅508 nm、檸檬黃426 nm、莧菜紅522 nm、胭脂紅510 nm、日落黃483 nm、亮藍630 nm。

用紫外檢測器分別在6種合成著色劑的最大吸收波長λmax和定波長λ254條件下進行檢測，計算λmax/λ254的響應比，見表1。

表1 6種合成著色劑λmax/λ254的響應比表

通過表1可以看出，日落黃和亮藍λmax/λ254增加明顯，其他組分變化不大。由于頻繁變換波長會影響基線的穩定性，因此可以在波長254 nm的基礎上，僅改變日落黃和亮藍的檢測波長，便可以達到提高檢測靈敏度的目的。根據各組分的保留時間，設計變波長程序，即：0～ 7.6 min波長 254 nm，7.6 min波長483 nm，8.1 min波長630 nm。

以濃度為50 mg/L的合成著色劑混合標準溶液在上述條件下進樣，得到色譜圖，如圖1所示。

圖1 混合標準溶液色譜圖（濃度50 mg/L）

2.2 樣品前處理條件優化

在GB5009.35-2016[2]中，樣品前處理的聚酰胺吸附法最后一步乙酸中和，由于乙酸與氨水反應生成乙酸鹽，蒸發比較困難，無法蒸干。本文優化該方法，去掉乙酸中和，改用旋轉蒸發器負壓蒸發，溶液易蒸干，蒸發速度快，損失少，后用pH 6的水定容，不引入新的雜質[3]。

2.3 標準曲線及線性范圍、檢出限

配制濃度為5、10、25、50、100 mg/L的6種合成著色劑混合標準溶液，在確定的色譜條件下進樣，橫坐標（x）為各合成著色劑的質量濃度（mg/L），縱坐標（y）為其相對應的峰面積，繪制標準曲線。根據3倍信噪比，計算各組分的檢出限。結果見表2。

表2 6種合成著色劑的標準曲線及檢出限、定量限表

由表2可以看出，6種合成著色劑在5～100 mg/L濃度范圍內R2等于1或接近于1，線性關系良好，本方法的檢出限為0.17～0.70 mg/L，滿足分析要求。

2.4 加標回收率及精密度的測定

稱取5.0 g碳酸飲料，超聲去除二氧化碳，分別添加濃度為10、25、50 mg/kg的6種合成著色劑混合標準溶液，經前處理后進行加標回收實驗，每個加標水平重復5次，計算6種合成著色劑的回收率及精密度，見表3。

表3 6種合成著色劑的回收率及精密度表（n=5）

由表3可知，6種合成著色劑的回收率在84.7%～99.2%，RSD為1.1%～2.6%，說明所建立的方法準確度好，精密度高。

3 結語

實驗表明，通過改進梯度洗脫條件、采用變波長檢測，同時優化飲料樣品的前處理方法，采用GB 5009.35-2016中聚酰胺吸附法，將最后一步乙酸中和改為由旋轉蒸發器負壓蒸發，后用pH 6的水定容，可以達到簡化處理過程、縮短實驗時間、提高實驗效率的目的。本文所涉及的儀器普及范圍廣，可以滿足常規分析的需求，適合于在普通實驗室中推廣使用。此方法結果準確，重現性好，可用于飲料中6種合成著色劑（新紅、檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍）的同時測定。

[1]朱麗君.食品中合成色素和工業染料的分析方法研究與應用[D].濟南：山東大學，2016.

[2]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.GB 5009.35-2016食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定[S].北京：中國標準出版社，2016.

[3]郝利平.食品添加劑[M].北京：中國農業大學出版社，2016.