基于適配體的雙酚A熒光檢測試紙條制備條件的優化

張 慧，姜 侃，厲永綱，胡小芳

（1.浙江省產品質量安全檢測研究院，浙江 杭州 310018；2.杭州創新生物檢控技術有限公司，浙江 杭州 310018）

雙酚A是一種有機化工原料，被廣泛用于食品包裝材料以提高容器的耐高溫、抗撞擊等性能。近年來有研究顯示，雙酚A進入身體后會導致動物或人體生殖系統的異常[1-2]、性早熟[3]、不育癥[4]等疾病。雙酚A的污染涉及水、土壤等的污染[5]，也可通過食品包裝或各種有機涂層遷移到食品中[6]，帶來食品安全隱患。國家標準GB 5749-2006《生活飲用水衛生標準》中規定雙酚A的限量為0.01 mg/L[7]；食品安全國家標準 GB 9685-2016《食品接觸材料及制品用添加劑使用標準》，雙酚A用于食品接觸用涂料、涂層，以及食品接觸材料及制品用粘合劑中時，其特定遷移限量為0.6 mg/kg[8]。

雙酚A常用的檢測方法有氣相色譜-質譜法[9]、液相色譜-質譜法[10]和酶聯免疫法[11]等。Minjoung Jo等人篩選出了雙酚A的單鏈寡核苷酸適配體[12]，并且有研究者利用核酸適配體的特異性識別作用，建立了雙酚A的納米金比色法[13]。

本文采用能特異性識別雙酚A的核酸適配體，制備基于適配體的雙酚A熒光檢測試紙條，并對試紙條的制備條件進行了優化研究。為后續建立雙酚A快速檢測新方法奠定了基礎。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

雙酚A標準品：98.5%；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）：98%；Trition X-100 及其他試劑均為分析純；硝酸纖維素（NC）膜：Millipore HF13504，Sartorius CN140，MDI150CNPH-N-SS40；羧基熒光微球，99 nm；核酸序列由寶生物工程（大連）有限公司合成。

實驗中的核酸序列如下。

Aptamer：

5’-CCGGTGGGT GGT CAGGTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA AAA AAA AAA AAA AAA AAAAAAAAAA-NH2-3’

Test-Probe 1：

5’-TGG TGCGAA CCC GTG ATG CGC TGG GCC ATA CGC GGA ACG CTA TCC CAC CTG ACCACCCACCGG-Biotin-3’

Control-Probe 2：

5’-Biotin-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTT-3’

1.1.2 儀器

GA-FDS-003-04連續點膜儀；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱；FD-1冷凍干燥機；Fics100熒光檢測儀。

1.2 方法

1.2.1 熒光微球的標記

熒光微球使用0.1 mol/L NaH2PO4溶液（pH=6.2）稀釋，混勻。然后加入新配制的Sulfo-NHS（終濃度50 mg/mL）和EDC（終濃度50 mg/mL）混勻，37℃、1500 r/min反應20 min。4℃離心，棄上層清液。再加入0.1 mol/L HEPES溶液（pH=7.3），混勻，加入 Aptamer（核酸：乳膠質量比=100 μg/mg），混勻后37℃、1500 r/min反應1.5 h。4℃離心，棄上層清液；加入2%乙醇胺溶液封閉，37℃，1500 r/min反應40 min，離心，棄上層清液；加入乳膠保存液，4℃保存，備用。

1.2.2 C/T線溶液反應方法（點膜）

將鏈霉親和素用 0.01 mol/L PBS（pH=7.4）稀釋成1 mg/mL，取5μL、1 mg/mL鏈霉親和素，與3.5 μL Control-probe 2（100 μmol/L）充分混合，加入31.5 μL、0.01 mol/LPBS（pH=7.4），37 ℃、1500 r/min反應0.5 h；同理制備T線溶液；將C/T線溶液點在Millipore 13504的硝酸纖維素膜上，干燥備用。

1.2.3 樣本處理緩沖液和跑膜時間的選擇

將熒光微球與適配體的偶聯物10倍稀釋液噴灑于結合墊上，凍干。硝酸纖維素膜Millipore13504上僅劃線Test-Probe1，室溫陰干備用。不同樣本處理緩沖液：①10 mmol/L pH=8.0的Tris溶液（含 1%TX-100），②10 mmol/L pH=7.4的PBS溶液（含1%TX-100），分別點樣，熒光檢測儀在15 min、30 min時檢測所劃測試線的熒光信號強度。

1.2.4 硝酸纖維素膜（NC膜）干燥方式的選擇

將C/T線處理好的硝酸纖維素膜Millipore 13504，采用陰干干燥、37℃烘干進行比較研究，結合墊噴灑適配體和熒光微球的偶聯物，樣本處理緩沖液點樣，熒光檢測儀檢測。

1.2.5 不同硝酸纖維素膜的選擇

將C/T線處理好的硝酸纖維素膜Millipore 13504、Satorous、MID NC膜進行 37℃烘干處理，樣本處理緩沖液點樣，熒光檢測儀檢測。

2 結果與分析

2.1 基本原理

本研究是利用核酸適配體（aptamer）可以和雙酚A特異性結合的特性，并且基于競爭法檢測雙酚A的原理制備試紙條。試紙條中結合墊位置噴灑含有羧基的熒光微球與含有氨基的核酸適配體的偶聯物；檢測線（T線）位置為Test-Probe1，是與aptamer互補的核酸序列，可與aptamer中的有效序列發生反應；控制線（C線）位置為Control-Probe 2，是一段與aptamer中連接臂互補的序列，可以捕獲連接臂。試紙條的顏色深淺與待測物質含量成反比，待測物質含量越高，T線顏色越淺，待測樣品不含待測物質則T線顏色最深。

2.2 樣本處理緩沖液和跑膜時間的優化

用熒光微球-適配體偶聯物制備試紙條，在NC膜上的中間位置僅劃T線，不同的樣本處理緩沖體系點樣，考察緩沖體系對測試信號強度的影響。檢測結果見圖1～4。

圖1 Tris樣本處理液跑膜15 min檢測信號圖（三條線為平行處理）

圖2 Tris樣本處理液跑膜30 min檢測信號圖（三條線為平行處理）

圖3 PBS樣本處理液跑膜15 min檢測信號圖（三條線為平行處理）

圖4 PBS樣本處理液跑膜30 min檢測信號圖（三條線為平行處理）

由圖1～圖4可知，使用熒光微球-適配體偶聯物制備試紙條，當采用Tris樣本處理緩沖液時，15 min和30 min時T線位置 （信號位置200左右）均沒有熒光信號出現；當使用PBS樣本處理液時，15 min時T線位置出現明顯的信號峰，信號強度達到150000以上；當試紙條放置30 min時，信號位置沒有變化，信號峰依然保持，并且信號強度保持不變或略有增加。研究表明，PBS樣本處理緩沖液更適合熒光微球-適配體偶聯物的遷移。因此，選用PBS緩沖液用于后續研究，并將試紙條的反應放置時間選擇為20 min。

2.3 硝酸纖維素膜（NC膜）干燥方式的選擇

在制備試紙條時，NC膜的干燥方式會對檢測信號產生一定的影響，圖5、圖6顯示了干燥方式對信號強度的影響。NC膜上劃有C線和T線，C線信號在位置100左右，T線信號在位置300左右。NC膜為Millipore HF13504。

圖5 NC膜干燥間陰干處理對檢測信號的影響（五條線為重復實驗）

圖6 NC膜37℃干燥處理對檢測信號的影響（五條線為重復實驗）

圖5 顯示NC膜在干燥間陰干處理時，多數實驗中C、T線信號較弱；NC膜37℃干燥處理時（圖6），5次重復實驗中C線、T線位置均出現了明顯的信號峰。因此，認為NC膜37℃烘干處理更適合檢測體系。

2.4 不同硝酸纖維素膜的選擇

為進一步改善熒光檢測信號，對不同的硝酸纖維素膜進行了選擇，研究結果見圖6～圖8。NC膜上劃有C線和T線，C線信號在位置100左右，T線信號在位置300左右。

圖7 Satorous NC膜37℃干燥處理對檢測信號的影響（五條線為重復實驗）

圖8 MIDNC膜37℃干燥處理對檢測信號的影響（五條線為重復實驗）

圖6 ～圖8顯示，三種NC膜37℃干燥處理后，在C線、T線均有熒光信號出現，并且圖6中Millipore HF13504 NC膜C、T線熒光信號較強；紫外燈下肉眼觀察，均可見熒光條帶，Millipore NC膜上的熒光條帶較亮。因此，后續實驗選擇Millipore HF13504NC膜，37℃干燥處理來制備試紙條。

2.5 試紙條的制備

采用優化的條件，制備基于適配體的雙酚A的熒光檢測試紙條，經不含待測物質樣品（空白樣本緩沖溶液）跑膜，C線、T線均出現明亮的熒光條帶，見圖9。該試紙條可用于雙酚A快速檢測方法的進一步研究。

圖9 制備的基于適配體的雙酚A熒光檢測試紙條

3 結論

本研究優化了雙酚A熒光檢測試紙條的部分制備條件，結果顯示：采用PBS樣本處理緩沖液、跑膜時間為20 min、硝酸纖維素膜37℃干燥2 h、硝酸纖維素膜為Millipore HF13504等優化條件，制備的基于適配體的雙酚A熒光檢測試紙條，樣品中不含待測物質時，C線、T線均有明亮的熒光條帶出現。該試紙條可用于基于競爭原理的雙酚A快速檢測方法的后續研究，為雙酚A快速檢測新方法的建立奠定了基礎。

[1]Shizuka H,Atsuko S，David L B，et al.Low dose effect of in utero exposure to bisphenol A and diethylstilbestrol on female mouse reproduction[J].Reproductive Toxicology，2002， 16（2）：117-122.

[2] Caroline M M，Macall A C，Carlos S，et al.Mammalian development in a changing environment：exposure to endocrine disruptors reveals the developmental plasticity of steroid-hormone target organs[J].Evolution ＆ development，2003， 5（1）：67-75.

[3] 喬麗麗，鄭力行，蔡德培.性早熟女童血清中雙酚A，辛基酚，4-壬基酚測定和分析[J].衛生研究，2010， 39（1）：9-12.

[4] 鄧茂先，吳德生，陳祥貴.雙酚A雄性生殖毒性的體內外實驗研究[J].中華預防醫學雜志，2004， 38（6）：383-387.

[5] Ching C L， Ling Y J，Yi L K，et al.The potential role of water quality parameters on occurrence of nonylphenol and bisphenol A and identification of their discharge sources in the river ecosystems[J].Chemosphere， 2013， 91（7）：904-911.

[6] Jose A B， Maria F， Olea S，et al.Xenoestrogens released from lacquer coationgs in food cans[J].Environmental health perspectives， 1995，103（6）：608.

[7] GB 5749-2006，生活飲用水衛生標準[S].

[8] GB 9685-2016，食品接觸材料及制品用添加劑使用標準[S].

[9] Abdelmonaim A，Andres J R，Evaristo B.Simultaneous determination of parabens， alkylphenols， phenylphenols， bisphenol A and triclosan in human urine， blood and breast milk by continuous solid-phanse extraction and gas charomatography-mass spectrometry[J].Journal of pharmaceutical and biomedical analysis， 2016，119：16-26.

[10]丁紅春，李建林，徐逸云，等.嬰幼兒奶瓶中遷移雙酚A的高效液相色譜-電噴霧串聯質譜檢測方法研究 [J].化學分析計量， 2010，19（5）：42-45.

[11]張麗莎，呂型超，陳涵倩，等.雙酚A殘留酶聯免疫分析方法的研究及應用[J].核農學報，2014，28（2）：234-239.

[12]Minjoung J， Ji Y A， Joohyung L，et al.Development of single-stranded DNA aptamers for sepecific bisphenol A detection[J].Oligonucleotides， 2011，21（2）：85-91.

[13]張東偉.核酸適配體應用于雙酚A快速檢測新方法研究[D].上海：上海應用技術大學，2016.