miR-126調控肺鱗癌細胞增殖的作用及機制研究

楊麗 劉雪萍 賀斌峰 孫曉蓉 張穎 郭雪梅 王霞

肺癌是嚴重威脅人類生命健康的主要疾病之一，其5年生存率低于30%。研究表明80%的肺癌為非小細胞肺癌(non small cells lung cancer, NSCLC)，其中肺鱗癌占NSCLC的30%[1-3]。目前由于肺鱗癌沒有特異性的治療靶點(如EGFR突變，VEGF)，因此肺鱗癌的治療策略并沒有像治療肺腺癌一樣有明顯的提高。故亟待探索新的靶點、策略來治療肺鱗癌。

microRNA(miRNAs)是一類僅有18-23 nt，不能編碼蛋白的RNA分子，其通過綁定靶mRNA的3’-非編碼區(untranslated region, UTR)或者5’ UTR，阻止mRNA的翻譯或者降解mRNA，進而下調靶蛋白的表達。研究表明miRNA通過調節其靶點的表達可影響腫瘤的生命活動，包括腫瘤的發生、細胞增殖和分化、遷移侵襲等[4]。既往研究表明miR-944參與了肺癌細胞的分化，可作為診斷肺鱗癌的分子標志物[5]。Suetsugu 等[6]發現miR-150-5p通過抑制基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)14，進而抑制肺鱗癌的進展。我們前期通過基因芯片發現miR-126等在肺鱗癌組織中較癌旁組織中有顯著的下調，但其在肺鱗癌進展中發揮怎樣的作用尚不清楚。因此，本文旨在探索miR-126在肺鱗癌進展中的作用并探索其相關機制。

材料與方法

一、主要材料

SK-MES-1細胞購自中科院上海細胞庫。MEM培養基、胎牛血清、培養基添加物GluMAX和丙酮酸鈉(Sodium Pyruvate) 購自GIBCO公司；TRIzol regent 購自上海sigma公司。定量PCR檢測試劑盒、熒光素酶報告基因檢測試劑盒、轉染ViaFect試劑，MTS細胞增殖檢測試劑盒、逆轉錄試劑盒購自promega公司；pMIR-REPORTTMluciferase和pRL-TK 質粒載體購自ABI生物技術公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自peromega公司。T4連接酶、HindⅢ和Spe Ⅰ限制性內切酶購自NEB公司。陰性對照(negative control, NC)、miR-126-5p模擬物(miR-126 mimic)、ARNT siRNA、兔源抗人β-actin抗體以及HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)二抗、cmv-3xFlag-NCoA7購自購自上海夢至生物科技公司。組織/細胞蛋白裂解液、NCoA7抗體、ARNT抗體、Flag抗體、瓊脂球(Beads)購自CST公司。miRNA逆轉錄試劑盒(加尾法)購自上海生工。

二、實驗方法

1. 肺鱗癌細胞SK-MES-1的培養: SK-MES-1細胞培養于含有10%胎牛血清的MEM培養基(加入1% GluMAX和1% 丙酮酸鈉)中。細胞置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度下的培養箱中傳代培養，取對數生長期的細胞進行實驗。

2. 肺鱗癌組織中miR-126的檢測: 取10對手術切除的肺鱗癌和癌旁組織各100 mg，加入1 ml TRIzol regent后用組織勻漿器勻漿，之后冰上裂解30 min。按照TRIzol提取總RNA試劑盒說明書提取細胞的總RNA。應用miRNA逆轉錄試劑盒(加尾法)進行逆轉錄。cDNA稀釋50倍后，采用BIO-RAD CFX96系統進行實時熒光定量PCR檢測miR-126的表達，以U6作為內參。miR-126的上游引物: 5’-ACGCCATTATTACTTTTGGTACGCG-3’。每個待測基因設4個復孔。數據通過BIO-RAD CFX96系統進行處理，按照公式RQ=2-△△CT計算各組間的倍數關系。

3. miR-126 mimic、NC、ARNT siRNA以及cmv-3xflag-NCoA7的轉染: 將miR-126 mimic、NC以及ARNT siRNA干粉用RNase-free H2O 配制成20 μmol/L的儲存液后，分裝、凍存備用。將SK-MES-1細胞消化后鋪在直徑6 cm的培養皿中，過夜后融合度達到60%～70%。棄去培養基后加入無血清的MEM培養基，再加入終濃度100 pM的miR-126 mimic和 20μl的轉染試劑，充分混勻后孵育6～8 h。棄去培養基，換成完全培養基后繼續培養48 h。NC以及ARNT siRNA的轉染同miR-126 mimic的轉染步驟。

4. MTS檢測細胞增殖: 將SK-MES-1細胞消化并制成細胞懸液，以5×103/孔的密度將細胞接種到96孔板。細胞經過轉染后，繼續培養0、12、24、48 h后，棄去培養基，加入100 μl新鮮的培養基以及20 μl的MTS試劑。37 ℃ 孵育3 h后，用酶標儀在450 nm處檢測各孔的吸光度值(OD值)，空白孔調零。

5. IP以及Western blot檢測: 將轉染flag-NCoA7質粒的細胞收集后，加入蛋白裂解液在冰上裂解30 min，加入Flag抗體(1︰50)后4 ℃震搖過夜。之后加入瓊脂球(beads)室溫孵育2 h， 3 000 rpm離心收集瓊脂球。加入2xloading buffer后沸水中煮10 min，之后進行western blot，具體方法同文獻[7]。

6. 熒光素酶報告基因檢測

①利用點突變技術擴增出含有HindIII和Spe I酶切位點的NCoA7突變位點的3’UTR; ②分別將野生型和突變型NCoA7 3’UTR 插入pMIR-REPORTTMluciferase vector載體；③分別將含有野生型和突變型NCoA7 3’UTR的 pMIR- luciferase質粒載體與pRL-TK質粒共轉染進入SK-MES-1細胞，然后分別將等量的miR-126 mimic和NC再轉染進入SK-MES-1細胞；④轉染48 h后，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測螢火蟲和海腎熒光素酶活性。

三、統計學方法

使用SPSS 17.0對數據進行分析，各實驗至少重復3次，數據呈正態分布，兩組間進行t檢驗，多組之間進行單因素方差分析，P<0.05為有統計學意義。

結 果

一、miR-126在肺鱗癌組織中表達下調

結果顯示，腫瘤組織的miR-126相對表達水平為0.38±0.27，癌旁組織的miR-126相對表達水平為1.38±1.04。肺鱗癌組織中miR-126的表達水平顯著低于癌旁組(P<0.05)。提示下調miR-126可能參與了肺鱗癌的發生、進展，見圖1。

圖1 qPCR檢測肺鱗癌及癌旁組織中miR-126的表達水平

二、上調miR-126抑制肺癌細胞SK-MES-1的增殖

結果顯示SK-MES-1細胞轉染miR-126 mimic后12、24、48 h miR-126的相對表達水平分別是0 h的1.67、5.92和8.35倍，顯著高于0h組(P<0.05)。通過MTS分析細胞活力顯示，miR-126 mimic組在24 h、48 h的值為0.71±0.007和0.66±0.03，而NC組為1.50±0.04和2.45±0.33 (P<0.05)。上述結果提示上調miR-126抑制肺癌細胞SK-MES-1的增殖，見圖2。

圖2 上調miR-126對SK-MES-1細胞增殖的影響；注：A：qPCR檢測SK-MES-1細胞轉染miR-126 mimic后不同時間點miR-126的表達水平；B：MTS檢測轉染miR-126 mimic和NC后不同時間點細胞活力的變化。*，與0 h組比較P<0.05

三、NCOA7是miR-126的下游靶點

通過miRNA預測軟件Targetscan以及MIRDB進行分析，推測NCoA7為miR-126的靶基因。熒光素酶報告基因實驗結果顯示，野生型(Wild type, WT)NCoA7 3’UTR質粒和miR-126 mimic共轉染組，其熒光素酶活性顯著低于野生型NCoA7 3’UTR質粒和NC共轉染組(P<0.05)。而突變型(mutation, Mut) NCoA7 3’UTR質粒和miR-126 mimic共轉染組與突變型 NCoA7 3’UTR質粒和NC共轉染組的熒光素酶活性無顯著差異(P>0.05)，說明NCoA7是miR-126的直接靶點(見圖3A)。此外，分析了上調miR-126后不同時間點NCoA7 mRNA和蛋白表達的變化。結果顯示，miR-126 mimic轉染12 h、24 h和48 h后NCoA7 mRNA和蛋白表達水平較0 h組顯著降低(P<0.05)(見圖3B和3C)，進一步說明NCoA7 是miR-126的直接靶點。

四、NCoA7與ARNT相互作用調控SK-MES-1細胞的增殖

為了分析NCoA7調控SK-MES-1細胞的增殖的機制。將flag-NCoA7轉染到SK-MES-1細胞后，再進行Co-IP檢測，發現ARNT與NCoA7蛋白之間存在相互作用(見圖4A)。結果發現應用miR-126 mimic上調后ARNT的表達在12、24和48 h時間點較0 h 組明顯下調(見圖4B)。將NC以及三條ARNT siRNA轉染SK-MES-1細胞48 h后檢測發現S1、S2、S3三條siRNA較NC組可顯著下調ARNT mRNA和蛋白的表達，其中S1和S2 siRNA序列的抑制效果較為明顯(見圖4C和4D)。此外，用S1和S2兩條siRNA轉染SK-MES-1細胞后，我們發現12、24和48 h時S1和S2組細胞活力顯著低于NC組(見圖4E)(P<0.05)。提示抑制ARNT可顯著抑制SK-MES-1細胞的增殖。

討 論

miR-126是由表皮生長因子樣域(epidermal growth factor-like domain 7, EGFL7) 基因的 pre-mRNA拼接和加重而形成的。EGFL7基因在血管系統發育和血管功能中發揮重要作用[8]。既往研究表明，miR-126在包括肺癌、胃癌、白血病、甲狀腺癌多種腫瘤中表達下調[9-13]。Felli等[14]在對黑色素瘤細胞的研究中指出miR-126通過直接/間接方式調控ADAM9 和MMP7的表達，進而發揮抑制腫瘤的作用。同樣，本研究明確了miR-126在肺鱗癌組織中的表達較癌旁組織是下調的。通過miR-126 mimic上調肺鱗癌細胞株SK-MES-1中miR-126的表達后，可顯著抑制細胞的增殖，說明miR-126在肺鱗癌中發也同樣發揮抑制腫瘤的作用。

圖3 NCOA7是miR-126的下游靶點；注： A：熒光素酶報告基因實驗檢測miR-126與NCoA7 3’UTR端結合。*，與NC組比較P< 0.05。B和C：qPCR和western blot檢測上調miR-126后NCoA7 mRNA和蛋白的表達水平。*，與0 h組比較P<0.05

圖4 NCOA7通過ARNT 相互作用發揮調控細胞增殖的作用；注：A：coIP檢測NCoA7與ARNT蛋白的相互作用；B：western blot檢測上調miR-126后不同時間點ARNT 蛋白的表達水平； C和D：應用三條ARNT siRNA轉染SK-MES-1細胞后qPCR和Western blot檢測ARNT的表達水平； E：轉染ARNT siRNA后MTS檢測細胞活力的變化；*，與NC組比較P<0.05

NCoA7，也稱作ERAP140。最初發現NCoA7中心域中非經典LXXLL模體(motif)與ERα有相互的作用。進一步研究發現其與TRβ、PPARγ 和RARα也存在相互作用[15]。此外，NCoA7還包含一個與抗氧化蛋白(oxidation resistance protein, OXR)1 類似的TLDc域。因此，NCoA7也可以發揮抵抗細胞氧化應激及其介導的DNA損害[16-17]。近期研究發現NCoA7不僅可以調節全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid, ATRA)介導的神經元分化，而且可作為神經細胞瘤預后的分子標志物[18]。Xie等[19]的研究發現過表達NCoA7可以促進口腔鱗癌細胞的增殖。本研究發現NCoA7是miR-126的靶點，并且上調miR-126可顯著抑制NCoA7的表達。基于上述結果，我們推測miR-126可能通過抑制NCoA7的表達，進而發揮抑制肺鱗癌細胞增殖的作用。

為了進一步探索NCoA7發揮調控細胞增殖作用的機制，我們通過生物信息學網站發現NCoA7可能與ARNT蛋白有相互作用。ARNT是堿性螺旋-環-螺旋(basic- helix- loop- helix, b HLH)轉錄因子超家族成員。既往研究表明ARNT與芳烴受體 (aryl hydrocarbon receptor, AhR)或者低氧誘導因子(hypoxia-inducible factor, HIF)1α/2α形成異二聚體[20-21]，綁定靶基因啟動子區域的異生物質反應元件(xenobiotic response elements, XREs)或二氧(雜)芑反應元件(dioxin responsive elements, DREs)，發揮調控p53、p21等基因表達的作用[22]。我們應用co-IP檢測發現，在SK-MES-1細胞中NCoA7與ARNT蛋白存在相互作用，并且上調miR-126也可以下調ARNT的表達。此外，我們應用ARNT siRNA抑制ARNT的表達后，發現可顯著抑制SK-MES-1細胞的增殖。因此，我們推測miR-126可能通過抑制NCoA7，影響ARNT的表達，進而抑制了肺鱗癌細胞的增殖。但ARNT如何調控SK-MES-1的增殖需要進一步的研究。

綜上所述，本文結果證實miR-126在肺鱗癌中的表達水平較低。在肺鱗癌細胞SK-MES-1中上調miR-126表達后，通過下調靶點NCoA7的表達，進而抑制ARNT介導的細胞增殖。miR-126可作為潛在的治療肺鱗癌的靶點。