吸煙慢性阻塞性肺疾病患者肺組織中OLA1表達與氧化應激、內質網應激的相關性分析

馮雙雙 陳劉通 廖晨 白莉

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是全世界范圍內發病率、病死率最高的疾病之一。吸煙是COPD發病的最主要的危險因素。吸煙所致高氧化應激(oxidative stress, OS)狀態下肺部結構細胞損傷/凋亡是COPD發生氣道重塑、肺氣腫的病理學基礎[1-5]。內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)可調控OS狀態下細胞存活或凋亡[6-8]。Obg樣ATP酶1(Obg-like ATPase1, OLA1)是抗OS的內源性負性調控因子，其表達水平的降低對OS狀態下的細胞具有保護作用[9-12]。前期研究也發現下調OLA1的細胞可減輕多種細胞ERS水平[13]。鑒于OS/ERS途徑與吸煙相關COPD形成過程中肺部結構細胞的損傷/凋亡密切相關，我們推測從OLA1入手調控OS/ERS有可能逆轉香煙暴露下肺部結構細胞損傷/凋亡，阻止COPD的發生。本文通過檢測人肺組織中OLA1、OS指標超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malonaldehyde, MDA)及ERS相關蛋白葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein of 78kD, GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein, CHOP)表達水平，探討人肺組織標本中OLA1表達水平與OS水平、ERS活化程度的相關性。

對象與方法

一、研究對象

研究對象肺組織標本來自2014年1月至2015年1月陸軍軍醫大學新橋醫院胸外科行肺葉切除術的24例肺癌患者。取材均為伴或不伴COPD并行肺葉切除的肺癌患者臨床標本，遠離原發癌灶5 cm以上且肉眼觀察無肺癌浸潤的外周肺組織。根據患者有無吸煙史將病例分為三組，每組各8例，最低年齡42歲，最高年齡72歲。非吸煙肺功能正常組，男6例，女2例，平均年齡(56.37±10.14)歲。吸煙肺功能正常組，男7例，女1例，平均年齡(56.75±2.12)歲。吸煙COPD組，男7例，女1例，平均年齡(60.75±8.55)歲。COPD的診斷符合2013年中華醫學會呼吸病學會修訂頒布的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》[8]，即患者吸入支氣管擴張劑后肺功能FEV1/FVC<70%，且不合并其他慢性疾病，手術前一周均處于穩定期。排除標準：具有除慢性阻塞性肺疾病以外的慢性肺部疾病、糖尿病、冠心病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病等。本研究項目經陸軍軍醫大學(第三軍醫大學)新橋醫院倫理委員會審查批準，患者簽署知情同意書。

二、研究方法

1. 試劑和儀器： 抗OLA1抗體、抗SOD抗體、抗MDA抗體均購自美國abcam公司，抗CHOP抗體、抗GRP78抗體購自美國Santa Cruz公司，倒置顯微鏡為日本Olympus公司。

2. 肺組織免疫組化染色及結果判定： 4%多聚甲醛固定肺組織標本，石蠟包埋切片、修復、封閉后滴加Ⅰ抗：抗OLA1抗體(1︰100)、抗SOD抗體(1︰200)、抗MDA抗體(1︰400)、抗CHOP抗體(1︰200)、抗GRP78抗體(1︰200)，PBS漂洗后滴加Ⅱ抗：山羊抗兔抗體(1︰400)，DAB顯色，蘇木精復染5 min后封片，最后鏡檢。結果分析：顯微鏡下觀察細胞染色程度(無顯色，0分；淡黃色，1分；淺褐色，2分；深褐色，3分)及陽性范圍(0～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；76%～100%，4分)，兩者分數相乘為最終分數。

三、統計學方法

采用SPSS22.0軟件進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差表示，多組間均數比較應用單因素方差分析，兩兩比較釆用LSD檢驗；兩指標的相關性采用Pearson線性相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、臨床基本資料

三組患者年齡、性別比較均無統計學意義(P>0.05)；吸煙COPD組體重指數明顯低于非吸煙肺功能正常組和吸煙肺功能正常組(P<0.05)；吸煙肺功能正常組和吸煙COPD組患者均有長期吸煙史，兩組之間無統計學差異(P>0.05)；非吸煙肺功能正常組和吸煙肺功能正常組肺功能FEV1%pred和FEV1/FVC均在正常范圍，但吸煙肺功能正常組肺功能較非吸煙肺功能正常組有所下降，吸煙COPD組肺功能明顯低于非吸煙肺功能正常組和吸煙肺功能正常組(P<0.05)，見表1。

二、OLA1、氧化應激指標及內質網應激相關蛋白在肺組織中表達情況

免疫組化半定量分析結果顯示OLA1、OS指標SOD、MDA及ERS相關蛋白GRP78、CHOP在人肺組織支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞中均有表達，OLA1、MDA、GRP78、CHOP在吸煙COPD組和吸煙肺功能正常組中表達明顯高于非吸煙肺功能正常組(P<0.05)，吸煙COPD組高于吸煙肺功能正常組(P<0.05)，SOD在吸煙COPD組和吸煙肺功能組中表達明顯低于非吸煙肺功能正常組(P<0.05)，吸煙COPD組低于吸煙肺功能正常組(P<0.05)，圖1和表2。

三、OLA1表達水平與OS水平、ERS活化程度的相關性分析

Pearson直線相關分析，OLA1在人肺組織中表達與OS指標SOD表達呈負相關(r=-0.643，P<0.01)，與MDA表達呈正相關(r=0.793，P<0.01)；與ERS相關蛋白GRP78呈正相關(r=0.815，P<0.01)、與CHOP表達呈正相關(r=0.843，P<0.01)。

討 論

吸煙是COPD發病的最重要的危險因素。吸煙所致高OS狀態下肺部結構細胞損傷/凋亡是COPD發生氣道重塑、肺氣腫的病理學基礎。既往研究證實由于肺部慢性炎癥和支氣管上皮細胞損傷，SOD的合成能力下降，SOD活性降低，MDA水平增高，從而導致機體失代償[14]。有研究證實氧化應激代謝產物MDA在吸煙相關COPD患者血清中表達水平高于非吸煙健康者，抗氧化酶SOD表達水平對比非吸煙健康者明顯降低，且MDA與SOD表達水平呈負性相關[15-16]。本文結果發現人肺組織中OS指標MDA在吸煙組患者(吸煙肺功能正常組和吸煙COPD組)肺組織中表達高于非吸煙患者(非吸煙肺功能正常組)，在吸煙COPD患者高于吸煙肺功能正常患者，抗氧化酶SOD表達則與MDA表達相反，SOD在吸煙患者肺組織中的表達低于非吸煙患者，在吸煙COPD患者肺組織中表達低于吸煙肺功能正常患者。本研究結果說明與非吸煙肺功能正常患者相比，吸煙患者肺內OS失衡更嚴重，提示肺內OS失衡在吸煙相關COPD的發病機制中可能起一定作用。

ERS是調控包括OS等多種應激狀態下細胞存活或凋亡的重要途徑，研究證實OS、ERS與糖尿病、哮喘、肺纖維化等慢性疾病發病機制相關[3-6,17-24]。大量證據表明香煙煙霧觸發肺內ERS并介導肺部細胞損傷/凋亡，參與COPD的發病機制[4,25]。應激條件下，ERS通路被激活，GRP78表達上調，促進內質網中未折疊蛋白正確折疊，以減輕ERS，恢復內質網和細胞內環境的穩態，起到一種細胞保護性機制的作用。CHOP作為一種內質網相關促凋亡蛋白，在過度ERS情況下大量表達，參與細胞損傷/凋亡途徑。研究發現CHOP、GRP78在吸煙相關COPD患者肺泡灌洗液中表達增高。研究不吸煙者、吸煙者、吸煙COPD患者肺組織中人支氣管上皮細胞(normal human bronchial epithelial cell, NHBE)中GRP78、CHOP表達水平，發現吸煙者與吸煙COPD患者NHBE中GRP78、CHOP表達高于不吸煙者，吸煙COPD患者的表達水平又高于吸煙者[26-29]。與上述研究結果相似，本研究中我們發現GRP78、CHOP在吸煙患者肺組織中表達增高，其中吸煙COPD患者表達高于吸煙肺功能正常患者，本研究結果說明與非吸煙肺功能正常患者對比，吸煙患者肺組織ERS活化程度加重，提示ERS通路激活可能參與了吸煙COPD的發病機制。

表1 三組患者臨床基本資料比較

表2 三組患者肺組織中OLA1、SOD、MDA、GRP78、CHOP的表達

圖1 OLA1、OS指標SOD、MDA及ERS相關蛋白GRP89、CHOP在人肺組織中的表達(×200)；注：A：非吸煙肺功能正常組；B：吸煙肺功能正常組；C：吸煙COPD組

OLA1是新近確認的抗OS內源性負性調控因子，研究發現下調OLA1表達可減輕細胞內ERS，ERS調控OS可促使細胞存活或者凋亡[30-33]。本究顯示OLA1在吸煙COPD患者和吸煙肺功能正常肺組織中表達明顯高于非吸煙患者，其中吸煙COPD患者肺組織表達又高于吸煙肺功能正常患者；提示OLA1表達上調可能參與吸煙相關COPD的發病機制。進一步對OLA1表達水平和OS、ERS標志物表達相關性分析顯示，OLA1表達水平與OS指標MDA、ERS相關蛋白GRP78、CHOP呈正相關，與OS指標SOD水平呈負相關，提示抗OS負性調控因子OLA1的表達與OS和ERS水平一致，表明OLA1可能是通過調控OS/ERS調控肺部結構細胞損傷/凋亡，進而參與COPD的發生。

綜上所述，OLA1可能是通過調控OS/ERS調控肺部結構細胞損傷/凋亡，進而參與COPD的發生。對其進行深入研究有助于揭示OLA1、OS、ERS在吸煙相關COPD發病中的作用機制，對了解吸煙相關COPD的發病和治療具有重要意義。