雙缺位Keggin型鎢酸鹽的體外抗腫瘤活性研究

林小淇+彭越鷥+夏夢雨+陳夢+高瑩雪+薛瑩雪

[摘要]目的 研究雙缺位Keggin型鎢酸鹽K8[γ-SiW10O36]·12H2O（簡稱KSiW10）的體外抗腫瘤活性。方法 應用四甲基偶氮唑鹽（3-[4，5-dimethylthiazo-2-y]-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）比色法分析KSiW10對人肝癌細胞（HepG2）、人肺癌細胞（A549）以及人乳腺癌細胞（MCF-7）的增殖抑制活性。采用光學顯微鏡觀察HepG2、A549和MCF-7三種腫瘤細胞在不同濃度藥物作用后的形態變化。結果 鎢酸鹽KSiW10能夠抑制這三種腫瘤細胞增殖，IC50值分別為9.8×10-5、3.6×10-4和1.8×10-4 mol/L，抑制作用具有藥物濃度依賴性。在經藥物KSiW10處理后，HepG2、A549和MCF-7三種腫瘤細胞的形態出現皺縮、變圓的變化。結論 鎢酸鹽KSiW10具有體外抗腫瘤活性，能夠抑制腫瘤細胞增殖。

[關鍵詞]缺位；鎢酸鹽；抗腫瘤；體外研究

[中圖分類號] R961 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）1（b）-0007-04

[Abstract]Objective To study the in vitro anti-tumor activity of di-lacunary Keggin-type tungstate K8[γ-SiW10O36]·12H2O （abbreviated form：KSiW10）.Methods The inhibitory effect of KSiW10 on the growth of human hepatoma HepG2 cells，lung cancer A549 cells and breast cancer MCF-7 cells was studied by MTT （3-[4，5-dimethylthiazo-2-y]-2，5-diphenyltetrazolium bromide） assay.The morphological change in HepG2，A549 and MCF-7 cells affected by different concentration of drugs was observed by optical microscopes.Results KSiW10 could inhibit HepG2，A549 and MCF-7 cells proliferation，with IC50 value of 9.8×10-5，3.6×10-4 and 1.8×10-4 mol/L，respectively，showing dose-dependent.The morphological changes in tumor cells showed shrinking of cells and round cells under an optical microscope after treating with different concentrations of KSiW10.Conclusion Tungstate KSiW10 has antitumor activity in vitro and can inhibit the proliferation of tumor cells.

[Key words]Lacunary；Tungstate；Anti-tumor；In vitro study

多酸又稱為聚金屬氧酸鹽（POM），是由高價態的過渡金屬離子如MoⅥ、WⅥ、VⅤ、NdⅤ等與O原子聚合形成的一類金屬-氧簇合物，具有一定的空間網絡結構[1]。由于多酸具有體積大、高的熱穩定性以及較大的分子式量、多樣的電子結構等特點，因此在抗病毒[2-3]、抗腫瘤[4-7]、抗菌[8-11]等方面的研究取得了顯著的成就。目前，抗腫瘤藥物大多數都具有較大的毒副作用、低效、選擇性差，并且腫瘤細胞對其有一定的耐藥性，因此，研發效率高、選擇性好、毒副作用小的抗腫瘤藥物是目前科研人員的首要任務。Keggin型結構的雜多酸鹽化合物具有較強的傳遞、儲存電子能力以及特異的結構特征，在抗腫瘤、抗病毒等方面的應用逐漸引起醫藥領域的重視[12-13]。本文參照文獻[14]合成雙缺位Keggin型鎢酸鹽K8[γ-SiW10O36]·12H2O，選擇人肝癌細胞（HepG2）、人肺癌細胞（A549）以及人乳腺癌細胞（MCF-7）對其增殖抑制活性進行研究。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

美國NICOLET公司紅外光譜儀（IMPACT 400 FTIR型，KBr壓片）；上海萬衡公司顯微鏡（XDS1C型）；湖南湘儀公司低速離心機（TDZ5-WS型）；美國BIORAD公司酶標儀（680型）；蘇州蘇凈集團超凈工作臺（SW-CJ-1B型）；其林貝爾公司微量振蕩器（MH-2型）。

青霉素鈉、硫酸鏈霉素（雙抗，購自西安制藥公司），二甲基亞砜（DMSO）、胰酶、MTT（均購自美國Sigma公司），1640培養液、胎牛血清（均購自GIBCO公司）。1640培養液溶解鎢酸鹽K8[γ-SiW10O36]·12H2O，配制母液濃度為10-2 mol/L，過濾除菌，-20℃保存備用。

1.2細胞株

HepG2、A549以及MCF-7（美國ATCC細胞庫）培養于含10%小牛血清的1640培養液[含鏈霉素、青霉素（100 U/ml）]中。

1.3 MTT法分析細胞增殖力

調節對數生長期的腫瘤細胞懸液密度為105個/ml，在96孔培養板中每孔加入200 μl的細胞懸液，培養24 h后，把腫瘤細胞分成空白對照組和實驗組（藥物的終濃度為10-5、10-4、2.5×10-4、5×10-4、10-3、2.5×10-3 mol/L），每孔培養液的總體積為200 μl，每個濃度及對照均設3個復孔。繼續培養6、12、24、48 h后，每孔加入20 μl的MTT溶液，繼續培養4 h使MTT還原成為甲瓚。培養終止時，倒掉上清液，每孔加入150 μl的DMSO，振蕩10 min，酶標儀中檢測570 nm波長處的吸光值（OD值）。增殖抑制率=（1-實驗組OD值/空白對照組OD值）×100%，重復實驗3次，取平均值。endprint

1.4腫瘤細胞的形態學觀察

取對數生長期的腫瘤細胞，待生長到70%～80%，將其分成不加藥物的對照組以及藥物實驗組，加入藥物K8[γ-SiW10O36]·12H2O至其終濃度為2.5×10-4、2.5×10-3 mol/L，繼續培養24 h后，在倒置顯微鏡下觀察腫瘤細胞經不同濃度藥物作用后的變化，從細胞形態、細胞增殖數目方面進行評估。

2結果

2.1紅外光譜

硅鎢酸鹽KSiW10的紅外譜圖見圖1，其在989、941、905、867、815、742、653、553、528、478 cm-1處有吸收峰。

2.2不同濃度KSiW10對腫瘤細胞形態學的影響

分別用藥物濃度為2.5×10-4、2.5×10-3 mol/L的KSiW10處理HepG2、A549和MCF-7腫瘤細胞，研究腫瘤細胞在經藥物作用后的形態變化，如圖2～圖4所示。在不加藥的對照組中，腫瘤細胞形狀是規則的多邊形，并且細胞生長緊貼瓶底，連接緊密，較少的圓形細胞，生長密集；而經過藥物KSiW10作用后的腫瘤細胞，隨著藥物濃度的升高，增殖數目明顯減少，細胞密度逐漸降低，細胞形態由規則的多邊形逐漸變圓、皺縮以及縮小。

2.3 MTT比色法分析腫瘤細胞增殖抑制率

活細胞的線粒體能夠將MTT還原成為紫色結晶體，其在570 nm波長處具有強烈的吸收。當細胞增殖能力下降甚至死亡時，紫色結晶體在該波長處的OD值會降低。研究不同濃度的鎢酸鹽KSiW10對HepG2、A549以及MCF-7三種腫瘤細胞的增殖抑制作用，MTT實驗結果如圖5～圖7所示。

2.3.1 KSiW10對HepG2細胞的增殖抑制作用 對于腫瘤細胞HepG2，藥物作用6 h時，最高抑制率為23.5%；12 h時，最高抑制率為65.52%；24 h時，最高抑制率為83.19%；在藥物作用48 h時，抑制率增幅不明顯，最高抑制率為83.4%，IC50值為9.8×10-5 mol/L（圖5）。

2.3.2 KSiW10對A549細胞的增殖抑制作用 對于腫瘤細胞A549，藥物作用6 h時，最高抑制率為30.4%；12 h時，最高抑制率為55.2%；24 h時，最高抑制率為83.5%；在藥物作用48 h時，抑制率達到最大，最高抑制率為93.1%，IC50值為3.6×10-4 mol/L（圖6）。

2.3.3 KSiW10對MCF-7細胞的增殖抑制作用 對于腫瘤細胞MCF-7，藥物作用6 h時，最高抑制率為36.9%；12 h時，最高抑制率為85.27%；24 h時，最高抑制率為92.3%；在藥物作用48 h時，抑制率增幅不明顯，最高抑制率為92.67%，IC50值為1.8×10-4 mol/L（圖7）。

從圖5～7中可以看出，KSiW10能夠抑制HepG2、A549和MCF-7三種腫瘤細胞增殖，并且隨著藥物濃度的增加，抑制率逐漸增大，具有藥物濃度依賴性。藥物作用時間越長，KSiW10對腫瘤細胞的抑制作用逐漸增強，提示硅鎢酸鹽KSiW10具有體外抗腫瘤活性。

3 討論

多酸的結構種類多樣，組成元素繁多，形成了種類多樣的化合物，其結構主要有Silverton型、Dawson型、Keggin型、Anderson型等，并且某些化合物表現出較好的體內外抗病毒和抗腫瘤活性[15]。

本文利用傅立葉紅外光譜儀對KSiW10進行結構表征，KSiW10的紅外譜圖與相關文獻[14]報道一致，提示KSiW10為所要合成的目標化合物，并且在1000～700 cm-1范圍內，吸收峰989、941、905、867、815 cm-1是W=Od鍵、Si-O鍵、W-Ob-W鍵和W-Oc-W鍵的特征峰[16]，是Keggin型雜多酸鹽的紅外特征譜峰，提示KSiW10具有Keggin型結構。

細胞增殖過剩或者凋亡細胞減少是惡性腫瘤形成的本質，最終導致腫瘤細胞生長失控，因此體外抗腫瘤活性實驗的主要依據是能否抑制細胞增殖或者誘導細胞凋亡。本文利用光學顯微鏡觀察藥物作用后的腫瘤細胞形態變化，并通過MTT法檢測雙缺位Keggin型鎢酸鹽KSiW10對HepG2、A549以及MCF-7的增殖抑制活性。結果顯示，KSiW10能夠抑制三種腫瘤細胞增殖，IC50值分別為9.8×10-5、3.6×10-4和1.8×10-4 mol/L，抑制作用具有藥物濃度及時間依賴性。光學顯微鏡下觀察到腫瘤細胞經藥物作用后，隨著藥物濃度的增加，細胞生長密度降低，增殖數目減少，圓形細胞增多，細胞形態逐漸皺縮、變圓。

綜上所述，KSiW10具有體外抗腫瘤活性，能夠對腫瘤細胞增殖起到抑制作用，并且半數有效濃度較小，這對于進一步研究多酸抗腫瘤作用機制及臨床應用具有重要的意義。本研究初步發現KSiW10具有顯著的抑制HepG2、A549以及MCF-7細胞增殖的活性，但對于其是否能夠誘導細胞凋亡還尚不明確，化學結構與抑制細胞增殖和凋亡機制間的聯系還需進一步研究。

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（收稿日期：2017-10-10 本文編輯：祁海文）endprint