應用消化系統全仿生模型分析酸奶發酵對鈣形態的影響

陳尚龍，陳安徽，劉 輝，劉恩岐，巫永華，秦 旭

0 引 言

Ca是人體第5大營養元素，也是人體骨骼的重要成分，約占人體質量的1.8%，它對調節生理功能和維持健康具有重要意義[1]，如何科學地補Ca一直都是研究熱點。之前，對食品中Ca的分析多限于總量測定[2-3]，形態分析較少。近年來相關研究報告[4-10]表明，無機態有益元素不易被人體吸收，生物活性低，攝入不當還會引起疾??；而有機態有益元素易被人體吸收[11]，對人類科學地補充有益元素有著更重要的意義。但牛奶在發酵成酸奶后，其中富含的有機Ca是否發生改變，對補Ca而言是否有利，這方面的研究報道甚少。

本試驗以市售純牛奶和實驗室發酵的酸奶為研究對象，采用體外全仿生消化（含消化酶）技術[12-15]對其進行預處理，研究酸奶發酵對Ca形態和生物可給性的影響。正辛醇在結構上與人體內的碳水化合物和脂肪類似[16]，試驗以正辛醇模擬細胞膜，建立正辛醇吸收模型，模擬純牛奶和酸奶中Ca在人體胃、腸中的吸收；鑒于消化道和血管間的生物膜為類脂質膜[17-19]，試驗以單層脂質體模擬細胞膜，建立單層脂質體吸收模型，模擬純牛奶和酸奶中Ca在人體胃、腸中的吸收。采用微波消解作為前處理方式，使用連續光源火焰原子吸收光譜法（continuum source flame atomic absorption spectrometry，CS FAAS）[20-27]測定各形態Ca的質量分數，為科學補Ca提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售純牛奶，實驗室自制酸奶（以上述純牛奶為原料發酵制得）。

高峰α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰酶、脂肪酶、豬膽粉、氨基葡萄糖鹽酸鹽、尿酸、粘蛋白、牛血清白蛋白、葡萄糖醛酸、尿素、硫氰酸鉀、卵磷脂（均為分析純） 上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、丙酮、無水葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、無水氯化鈣、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化銨、磷酸三鈉、氯化鎂、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、正辛醇（均為分析純），國藥集團化學試劑有限公司；濃硝酸、30%（體積分數，下同）過氧化氫、KCl、La(NO3)3（均為優級純），國藥集團化學試劑有限公司；乳酸菌酸奶發酵劑，北京川秀科技有限公司；綿白糖（食品級），徐州人和居食品廠；Ca標準溶液（1 g/L），國家化學試劑質檢中心。

1.2 儀器與設備

ContrAA700高分辨-連續光源原子吸收光譜儀（配MPE60自動進樣器，簡稱HR-CSAAS），德國Analytik Jena公司；XT-9900型智能微波消解儀、XT-9800多用預處理加熱儀，上海新拓微波溶樣測試技術有限公司；Cascada實驗室超純水系統，美國Pall公司；SIGMA3-30K臺式高速冷凍離心機，德國SIGMA公司；L550臺式低速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 儀器工作條件

使用HR-CS AAS（火焰法）測定Ca的工作條件：波長為422.672 8 nm，火焰類型為C2H2-Air，燃燒器類型為100 mm。

在使用HR-CS AAS測定Ca時，流量比（乙炔/空氣）和燃燒器高度都是影響測定結果的重要參數[1]。由于ContrAA 700 HR-CS AAS的空氣流量為470 L/h，無法調節，改變流量比只能通過調節乙炔流量。通過優化，試驗選擇最佳乙炔流量為70 L/h，最佳燃燒器高度為6 mm。

1.3.2 標準工作曲線的配制

用0.5% HNO3將Ca標準溶液（1 g/L）進行逐級稀釋，配制成0～10 mg/L的標準系列溶液，并向其中添加KCl和La(NO3)3溶液[1]，使其都含有質量分數1% KCl和質量分數0.5% La(NO3)3。

1.3.3 酸奶發酵

工藝流程：純牛奶→配料→殺菌→冷卻→接種→攪拌→灌裝→發酵→冷藏→成品。

操作要點：本試驗以分析所用純牛奶為原料，加入質量分數4%綿白糖，溶解后煮沸5 min以達到殺菌效果。冷卻至室溫后加入質量分數0.1%乳酸菌酸奶發酵劑，攪拌混勻后將其裝入玻璃罐中（高溫殺菌），密封，放入 45℃恒溫培養箱中，培養6 h后轉移至冰箱中冷藏備用。

1.3.4 樣品前處理及其Ca的測定

將樣品（5～10 g，精確至0.1 mg）、濃HNO3（5～10mL）和30% H2O2（2～5 mL）一起置于微波消解罐中，在多用預處理加熱儀上進行預處理0.5～1 h，溫度由室溫逐級上升至120℃。再加入2 mL 30% H2O2，按表1中條件進行微波消解，結束后將溶液轉移至50 mL燒杯中加熱至近干，用0.5% HNO3溶液多次沖洗燒杯中的樣液，并將沖洗液轉移至25 mL容量瓶中，用0.5% HNO3溶液定容至刻度，搖勻備用，同時以同樣方法做空白對照[27]。根據Ca濃度的高低，用0.5% HNO3溶液對其進行適當倍數的稀釋，稀釋時向其中添加KCl和La(NO3)3溶液，使其都含有質量分數1% KCl和質量分數0.5% La(NO3)3，然后再用HR-CS FAAS進行測定。

表1 微波消解條件Table 1 Conditions of microwave digestion

在使用HR-CS AAS測定Ca時，為了消除磷酸根等離子的干擾，通常選擇添加硝酸鑭作為釋放劑，鑭離子可以與磷酸根形成磷酸鑭，從而將Ca從磷酸鈣中釋放出來，干擾和釋放反應方程如公式（1）～（2）[1]。

試驗固定其他參數，只改變待測樣品中硝酸鑭質量分數，測定Ca的吸光度，如圖1所示。

圖1 硝酸鑭質量分數對吸光度的影響Fig.1 Effect of La(NO3)3 mass fraction on absorbance

由圖 1可知，硝酸鑭質量分數對吸光度有較大的影響，試驗選擇待測樣品中最佳硝酸鑭質量分數為0.5%。

1.3.5 仿生液的制備

胃、腸全仿生消化液的制備：根據表2，分別加入唾液、胃液、十二指腸液和膽汁中所含的有機物和無機物，利用HCl和NaHCO3調整pH值，再用超純水定容至500 mL，置于 4℃冷藏保存備用。使用前，在此基礎上分別加入相應的消化酶。

胃全仿生提取液的制備：準確稱取125 g純牛奶（酸奶）置于1 000 mL三角瓶中，加入5.00 mL唾液，在37℃下恒溫振蕩5 min后（振蕩速度為60 r/min），再加入75.0 mL胃液，在37℃下恒溫振蕩2 h（振蕩速度為60 r/min），結束后離心20 min（離心速度為4 200 r/min）達到固液分離，得上清液（胃全仿生提取液），并稱量質量，置于4℃冷藏保存備用。

腸全仿生提取液的制備：準確稱取125 g純牛奶（酸奶）置于1 000 mL三角瓶中，加入5.00 mL唾液，在37℃下恒溫振蕩5 min后（振蕩速度為60 r/min），加入75.0 mL胃液，在37℃下恒溫振蕩2 h（振蕩速度為60 r/min），再加入100.0 mL十二指腸液和40.0 mL膽汁，在37℃下恒溫振蕩7 h（振蕩速度為 60 r/min），結束后離心20 min（離心速度為4 200 r/min）達到固液分離，得上清液（腸全仿生提取液），并稱量質量，置于4℃冷藏保存備用。

1.3.6 不同形態Ca的分離和測定

可溶態與懸浮態的分離和測定：準確稱取40 g全仿生提取液置于50 mL離心管中，離心10 min（離心速度為11 000 r/min）后取上清液，再過0.45 μm濾膜，得可溶態溶液[18]，并稱量質量。按 1.3.4節方法對可溶態溶液進行消解和測定，測定結果為可溶態Ca質量分數，再將剩余可溶態溶液置于4℃冷藏保存備用。

懸浮態Ca = Ca總量 - 可溶態Ca （3）

可溶態中有機態和無機態的分離和測定：準確稱取5.0 g可溶態溶液，過D101大孔吸附樹脂（用2倍體積左右的無水乙醇浸泡24 h左右，去離子水沖至中性），用1% HNO3以2.0 mL/min的流速洗滌樹脂，收集250 mL洗出液，按1.3.4節方法對洗出液進行消解和測定[28]，測定結果為可溶態中無機態Ca質量分數。

表2 唾液、胃液、十二指腸液、膽汁組成成分表[18,29]Table 2 Main components of saliva, gastric juice,duodenal juice and bile

1.3.7 吸收模型的制備及其體外吸收

正辛醇吸收模型的制備：取適量正辛醇與超純水以體積比 1∶10進行混合，強力振蕩均勻后轉移至分液漏斗中，避光靜置12 h待其分層，上層為被水飽和的正辛醇，下層為被正辛醇飽和的水，避光保存，備用。

正辛醇吸收模型的體外吸收：準確移取1.00 mL可溶態溶液置于50 mL離心管中，加入1.00 mL被水飽和的正辛醇和20.00 mL被正辛醇飽和的水，在37 ℃下恒溫振蕩5 h（震蕩速度為250 r/min）后，再在4 ℃下恒溫離心10 min（離心速度為11 000 r/min），結束后用膠頭滴管吸去離心管上層正辛醇相，最后用超純水將剩余溶液定容至25 mL，按1.3.4節方法對上述溶液進行消解和測定，測定結果為正辛醇吸收模型中水溶態Ca質量分數。

正辛醇吸收模型中分配系數 KOW值為正辛醇醇溶態Ca和正辛醇吸收模型中水溶態Ca的比值，KOW值越大，說明親脂性Ca質量分數越高，越有利于人體吸收。

單層脂質體吸收模型的制備：準確稱取0.001 g蛋黃卵磷脂溶于10.00 mL氯仿，溶解后將其轉移至具塞圓底燒瓶中，然后置于 37 ℃真空旋轉蒸發，直至形成均勻的多層脂質體膜。

單層脂質體吸收模型的體外吸收：準確移取5.00 mL可溶態溶液置于50 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度后，全部轉移至上述圓底燒瓶中，充氮氣后蓋好涂有凡士林的塞子，在 37 ℃下恒溫振蕩 1 h（振蕩速度為 100 r/min），使脂質體膜全部進入溶液中。然后將全部溶液轉移至100 mL塑料管中，在超低溫冰箱（-80 ℃）中冷凍20 min后取出，置于37 ℃水浴中融化，重復凍融3次，促進可溶態在單層脂質體-水體系中的分配。由于單層脂質體粒徑為0.3～0.35 μm，用0.22 μm濾膜抽濾上述凍融液，收集濾液[18]，按1.3.4節方法對濾液進行消解和測定，測定結果為單層脂質體吸收模型中水溶態Ca質量分數。

單層脂質體親和態Ca

= 可溶態Ca - 單層脂質體吸收模型中水溶態Ca （5）

單層脂質體吸收模型中分配系數DMW值為單層脂質體親和態Ca和單層脂質體吸收模型中水溶態Ca的比值，DMW值越大，說明親脂性Ca質量分數越高，越有利于人體吸收。

1.3.8 Ca生物可給性的計算

純牛奶（酸奶）胃、腸全仿生提取液中Ca生物可給性的計算如式（6）。

式中BA為Ca的生物可給性，%；TK為純牛奶（酸奶）胃、腸全仿生提取液中可溶態Ca質量分數，mg/g；

TZ為純牛奶（酸奶）中Ca總量（mg/g）。

2 結果與分析

2.1 標準工作曲線的繪制

在選定工作條件下，使用HR-CS FAAS順序測定Ca標準系列溶液。以質量濃度(c)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標，經ASpect CS軟件繪制非線性標準工作曲線，如圖2所示，所得回歸方程為A=(0.002 934 2＋0.047 136 5×c)/(1＋0.020 721 6×c)，特征濃度0.097 mg/L，相關系數為0.999 1，說明在0～10 mg/L范圍內，Ca質量濃度與吸光度呈現良好的關系。

圖2 標準工作曲線Fig.2 Standard working curves

2.2 加標回收率

在純牛奶樣品中加入一定量Ca標準溶液（加標水平為5.0 mg/g），然后置于微波消解罐中進行微波消解，按1.3.4節進行操作，重復6次。在選定工作條件下進行測定，計算加標回收率[30]，分別為96.3%、95.7%、97.8%、94.3%、95.7%和96.5%，平均加標回收率為96.1%，RSD=1.20%，表明使用該方法測定Ca，結果準確可靠。

2.3 純牛奶、酸奶胃全仿生提取液中 Ca的形態分析及生物可給性

按上文方法分別對純牛奶和酸奶進行處理，根據Ca的標準工作曲線計算出各形態Ca質量分數，同時通過t檢驗檢驗數據之間是否有顯著差異，結果見表3。

表3 純牛奶、酸奶胃全仿生提取液中各形態Ca質量分數及生物可給性Table 3 Speciation analysis and bioavailability assessment of Ca in gastric all bionic extraction solutions of milk and yogurt

由表3可知，純牛奶和酸奶中都含有豐富的Ca，分別為 12.894±0.133 mg/g和15.920±0.157 mg/g，酸奶中Ca質量分數高于純牛奶，這是由于試驗在發酵酸奶時，沒有添加增稠劑，導致大量的乳清析出，使酸奶質量變小，Ca質量分數變高。在純牛奶胃全仿生提取液中可溶態 Ca為5.364 mg/g，其中有機態Ca占總量的26.95%，正辛醇醇溶態Ca和單層脂質體結合態Ca分別占總量的32.88%和33.71%，KOW值和DMW值分別為3.77和4.27，Ca的生物可給性為41.60%；在酸奶胃全仿生提取液中可溶態Ca為7.228 mg/g，其中有機態Ca占總量的36.80%，正辛醇醇溶態Ca和單層脂質體結合態Ca分別占總量的36.63%和38.10%，KOW值和DMW值分別為4.18和5.21，Ca的生物可給性為45.40%。

可溶態和無機態的t值都大于2.78，表明在0.05顯著性水平上所測得結果的平均值顯著差異；正辛醇吸收模型和單層脂質體吸收模型中水溶態的t值都小于2.78，表明在0.05顯著性水平上所測得結果的平均值沒有顯著差異。

綜上所述，在酸奶胃全仿生提取液中可溶態Ca、有機態Ca、正辛醇醇溶態Ca和單層脂質體結合態Ca的質量分數和所占總量百分比都高于純牛奶，KOW值、DMW值和生物可給性也高于純牛奶。因此，在胃消化階段，酸奶的補Ca效果優于純牛奶。

2.4 純牛奶、酸奶腸全仿生提取液中 Ca的形態分析及生物可給性

按上文方法分別對純牛奶和酸奶進行處理，根據Ca的標準工作曲線計算出各形態Ca質量分數，同時通過t檢驗檢驗數據之間是否有顯著差異，結果見表4。

表4 純牛奶、酸奶腸全仿生提取液中各形態Ca質量分數及生物可給性Table 4 Speciation analysis and bioavailability assessment of Ca in intestinal all bionic extraction solutions of milk and yogurt

由表4可知，在純牛奶腸全仿生提取液中可溶態Ca為8.237 mg/g，其中有機態Ca占總量的45.36%，正辛醇醇溶態Ca和單層脂質體結合態Ca分別占總量的49.81%和54.35%，KOW值和DMW值分別為3.54和5.70，Ca的生物可給性為63.88%；在酸奶腸全仿生提取液中可溶態Ca為10.556 mg/g，其中有機態Ca占總量的47.91%，正辛醇醇溶態 Ca和單層脂質體結合態 Ca分別占總量的52.98%和57.14%，KOW值和DMW值分別為3.97和6.24，Ca的生物可給性為66.31%。

可溶態和正辛醇吸收模型中水溶態的 t值都大于2.78，表明在 0.05顯著性水平上所測得結果的平均值顯著差異；無機態和單層脂質體吸收模型中水溶態的t值都小于2.78，表明在0.05顯著性水平上所測得結果的平均值沒有顯著差異。

綜上所述，在酸奶腸全仿生提取液中可溶態Ca、有機態Ca、正辛醇醇溶態Ca和單層脂質體結合態Ca的質量分數和所占總量百分比都高于純牛奶，KOW值、DMW值和生物可給性也高于純牛奶。因此，在腸消化階段，酸奶的補Ca效果也優于純牛奶。

3 結 論

1）試驗采用體外全仿生消化技術模擬純牛奶和酸奶在人體胃、腸的消化過程，通過0.45 μm微孔濾膜和D101大孔樹脂實現不同形態Ca的分離。

2）分別以正辛醇和單層脂質體模擬細胞膜，建立正辛醇吸收模型和單層脂質體吸收模型，模擬純牛奶和酸奶中Ca在人體胃、腸中的吸收。

3）使用微波消解-HR-CS FAAS測定純牛奶和酸奶中Ca分別為12.894和15.920 mg/g，酸奶中Ca質量分數高于純牛奶。在酸奶胃、腸全仿生提取液中可溶態Ca、有機態Ca、正辛醇醇溶態Ca和單層脂質體結合態Ca的質量分數和所占總量百分比都高于純牛奶，KOW值、DMW值和生物可給性也高于純牛奶，表明酸奶的補Ca效果優于純牛奶。

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