青娥方對(duì)去卵巢大鼠血清MMP-9、TRACP5b、Cath-K及骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

王柄棋，羅文娟，孫雨晴，陳 翔，林燕萍

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥主要是由于絕經(jīng)后婦女體內(nèi)雌激素水平下降，骨重建失偶聯(lián)，骨吸收大于骨形成所致，屬于高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥，其中破骨細(xì)胞骨吸收增強(qiáng)是其發(fā)病的主要機(jī)制之一。基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotrinse 9，MMP-9）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tatrate-resistant acid phosphatase，TRACP）、組織蛋白酶 K（cathepsink，Cath-K）是骨吸收過(guò)程中重要的骨基質(zhì)降解酶，脫氧吡啶啉（deoxypyridinoline，DPD）是骨I型膠原的降解產(chǎn)物。以上3種酶及尿DPD都是骨吸收的特異性生化指標(biāo)，能客觀、特異、準(zhǔn)確反映破骨細(xì)胞的功能活性，顯示骨組織代謝中的骨吸收狀況。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察補(bǔ)腎傳統(tǒng)良方青娥方對(duì)去卵巢大鼠血清中 MMP-9、TRACP5b、Cath-K 含量和尿液 DPD／Cr的影響，結(jié)合骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)一步探討青娥方的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 120只3月齡SPF級(jí)雌性SD大鼠，體質(zhì)量（305±15）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002；由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，許可證號(hào)：SYXK（閩）2014-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 青娥方藥物組成：杜仲（鹽炒）480 g，補(bǔ)骨脂（鹽炒）240 g，核桃仁（炒）150 g，大蒜 120 g。購(gòu)自福建省國(guó)醫(yī)堂，由福建中醫(yī)藥大學(xué)求真樓中藥平臺(tái)加工成浸膏，每克浸膏含生藥5.79 g。骨疏康顆粒購(gòu)自遼寧康辰藥業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 TRACP、MMP-9、Cath-K、DPD ELISA試劑盒（上海西塘生物技術(shù)有限公司）；肌酐檢測(cè)試劑盒（南京建成生物研究所）；乙二胺四乙酸二鈉（上海博亞生物技術(shù)公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 酶標(biāo)儀（美國(guó)Hologic公司，ELx 800）；切片機(jī)（德國(guó) LEICA 公司，RM2135）；超低溫－80℃冰箱（日本SANYO公司，MDF-382E）；生物組織自動(dòng)包埋機(jī)（湖北泰維醫(yī)療科技有限責(zé)任公司，TB-718E）；電動(dòng)離心機(jī)（金壇市恒豐儀器廠，YJ80-2）；光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模和干預(yù) 120只大鼠在動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，用隨機(jī)數(shù)字表法按1∶2的比例分為假手術(shù)組和卵巢摘除組。卵巢摘除組行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)，將大鼠仰臥位固定，取腹部正中切口，鈍性分離暴露腹腔，找出雙側(cè)卵巢，完全結(jié)扎并切除，術(shù)后肌肉注射青霉素（每次8萬(wàn)單位／d），連續(xù)注射3 d。假手術(shù)組也取腹部正中切口但不切除雙側(cè)卵巢，其余步驟同卵巢摘除組。術(shù)后卵巢摘除組再用隨機(jī)數(shù)字表法按1∶1∶1的比例分為生理鹽水組、青娥方組和骨疏康組。實(shí)驗(yàn)大鼠均于術(shù)后第3天開(kāi)始藥物干預(yù)。給藥劑量根據(jù)人和動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量比值表計(jì)算，并根據(jù)大鼠體質(zhì)量變化實(shí)時(shí)調(diào)整給藥劑量。青娥方組按3.6 g／（kg·d）的劑量灌服青娥方生藥，骨疏康組按 1.8 g／（kg·d）的劑量灌服骨疏康顆粒，假手術(shù)組、生理鹽水組每天予灌服生理鹽水2 mL／只。各組分別于干預(yù)4、8、12周時(shí)分批處死取材。

2.2 取材 取材前1天，將各組大鼠按1只／籠置于代謝籠中，予禁食不禁水處理，收集24 h尿液，離心取上清液，分裝后儲(chǔ)存于－80℃冰箱；腹主動(dòng)脈取血，充分靜置，2 000 r／min，離心 20 min，分裝后置于－80℃冰箱凍存；分離大鼠左側(cè)脛骨上段，固定后脫鈣。

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 血清生化指標(biāo)及尿DPD含量檢測(cè) 從－80℃冰箱中各取出1份分裝好的血清和尿液樣品，室溫下平衡30 min，確定酶標(biāo)板中的上樣孔數(shù)。參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，在波長(zhǎng)450 nm處讀取A值，并根據(jù)A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本血清MMP-9、TRACP5b、Cath-K及尿DPD的含量。

2.3.2 尿肌酐檢測(cè) －80℃冰箱取出1份尿液，用純水按1∶200比例稀釋?zhuān)瑓⒖技◆噭┖姓f(shuō)明書(shū)，以波長(zhǎng)510 nm檢測(cè)各管吸光值，并計(jì)算DPD／Cr比值。

2.3.3 骨組織HE染色及骨小梁面積百分比 分離大鼠左脛骨上段，將周?chē)浗M織剃凈，多聚甲醛固定，10%EDTA／PBS（pH7.4）脫鈣，石蠟包埋切片，HE染色后鏡下觀察脛骨干骺端的形態(tài)結(jié)構(gòu)。應(yīng)用數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（Motic Med 6.0），測(cè)定骨小梁面積百分比（Tb.Ar%）。

骨小梁面積百分比（Tb.Ar%）＝視野測(cè)量框內(nèi)骨小梁的面積（Tb.Ar） ／測(cè)量框總面積（T.Ar）×100%

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

卵巢摘除過(guò)程中，因腹腔出血等原因死亡的大鼠共7只，其中干預(yù)4周假手術(shù)組、生理鹽水組、青娥方組、骨疏康組和干預(yù)8周生理鹽水組、青娥方組、骨疏康組每組各1只，共取材113只。

3.1 4組不同干預(yù)時(shí)間血清 MMP-9、TRACP5b、Cath-K變化比較 見(jiàn)圖1～圖3。

3.2 4組不同干預(yù)時(shí)間尿DPD／Cr比較 見(jiàn)圖4。

3.3 骨組織形態(tài)學(xué)變化情況 卵巢摘除后，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組骨小梁形態(tài)大致相同，骨小梁分布均勻，排列規(guī)則，交織呈網(wǎng)狀。生理鹽水組骨小梁改變明顯，出現(xiàn)不同程度的變細(xì)、變形，呈碎片、斷裂現(xiàn)象。青娥方組和骨疏康組骨小梁完整性不及同期假手術(shù)組，但骨小梁數(shù)目、排列以及結(jié)構(gòu)完整性均優(yōu)于同期生理鹽水組。骨小梁面積百分比檢測(cè)結(jié)果與光鏡下所見(jiàn)基本一致。見(jiàn)圖5、圖6。

圖1 4組不同干預(yù)時(shí)間血清MMP-9含量比較

圖2 4組不同干預(yù)時(shí)間血清TRACP5b含量比較

圖3 4組不同干預(yù)時(shí)間血清Cath-K含量比較

圖4 4組不同干預(yù)時(shí)間尿DPD／Cr含量比較

圖5 4組大鼠干預(yù)12周后骨組織HE染色圖（×50）

4 討論

骨骼塑造完成后，隨著年齡的增長(zhǎng)，生物力學(xué)環(huán)境發(fā)生改變，骨骼通過(guò)不斷的老骨移除和新骨替換來(lái)維持骨的正常功能。“活化—吸收—形成”是骨重建過(guò)程的特點(diǎn)，在所有骨重建表面，都要經(jīng)過(guò)骨吸收、骨形成及靜止幾個(gè)階段［1］。破骨細(xì)胞在骨重建中有著啟動(dòng)作用，其骨吸收功能的發(fā)揮首先需要向骨基質(zhì)遷移、粘附，然后破骨細(xì)胞極化，使皺褶緣、封閉區(qū)與骨基質(zhì)表面形成一個(gè)密閉的空間，構(gòu)成骨吸收裝置，在富含H＋及相關(guān)降解酶的環(huán)境下溶解骨質(zhì)［2］。骨基質(zhì)的降解產(chǎn)物由細(xì)胞內(nèi)吞并經(jīng)跨胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)空泡，從皺褶緣運(yùn)送到功能性分泌結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而釋放到細(xì)胞外環(huán)境，被血液運(yùn)輸?shù)侥I臟，經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)隨尿液排出體外。

圖6 用藥后不同時(shí)間各組Tb.Ar%比較

MMP-9在破骨細(xì)胞中特異性高表達(dá)，主要降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅹ型膠原。研究發(fā)現(xiàn)隨著絕經(jīng)后婦女血清MMP-9水平的升高，骨基質(zhì)降解，骨密度逐漸降低［3-7］。 Bolton 等［5］認(rèn)為 MMP-9 在骨吸收過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，其實(shí)驗(yàn)研究顯示血清中MMP-9濃度與BMD值呈負(fù)相關(guān)，證實(shí)了他的觀點(diǎn)。TRACP5b是TRACP的同工酶，特異性高表達(dá)于破骨細(xì)胞，也是血中TRACP5b的主要來(lái)源［6］，并在一定程度上反映了破骨細(xì)胞的功能活性［8-9］。Cath-K在靜止的破骨細(xì)胞中主要以不活躍的Cath-K前體形式存在，Cath-K前體是一條未糖基化的多肽單鏈，在酸性環(huán)境下可轉(zhuǎn)換為具有活性的Cath-K［10］。Cath-K在破骨細(xì)胞中顯著表達(dá)，能降解骨基質(zhì)中的Ⅰ型膠原蛋白、骨橋接素和骨連接素，是骨吸收過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶［11-14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示卵巢切除后，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的生理鹽水組血清MMP-9、TRACP5b、Cath-K的含量均高于同期假手術(shù)組（P＜0.01，P＜0.05），表明卵巢切除后，隨著雌激素水平的下降，血清中骨基質(zhì)降解酶的含量逐漸升高，骨吸收增強(qiáng)。干預(yù)后青娥方組血清MMP-9、TRACP5b、Cath-K的含量均低于同期生理鹽水組（P＜0.01，P＜0.05），說(shuō)明青娥方能夠降低血清中骨基質(zhì)降解酶的含量，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞對(duì)骨基質(zhì)的降解。

DPD是骨膠原纖維的代謝產(chǎn)物，僅存于骨和牙的Ⅰ型膠原纖維中，而后者含量甚微，故尿液中DPD幾乎來(lái)源于骨骼，能準(zhǔn)確反應(yīng)骨膠原纖維的分解代謝［15-16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)生理鹽水組尿DPD／Cr比值均高于同期假手術(shù)組（P＜0.01，P＜0.05），提示卵巢切除后，破骨細(xì)胞對(duì)骨Ⅰ型膠原的降解作用加強(qiáng)；而青娥方組尿DPD／Cr比值均低于同期生理鹽水組（P＜0.01，P＜0.05），表明青娥方能夠降低破骨細(xì)胞的功能活性，抑制其對(duì)骨Ⅰ型膠原的降解。同時(shí)，骨組織形態(tài)結(jié)果顯示生理鹽水組骨小梁數(shù)目、排列以及結(jié)構(gòu)完整性明顯不及同期假手術(shù)組，Tb.Ar%在8、12周均明顯低于同期假手術(shù)組（P＜0.01，P＜0.05），提示卵巢切除后，骨吸收增強(qiáng)，骨組織形態(tài)遭到破壞；青娥方組骨小梁數(shù)目、排列以及結(jié)構(gòu)完整性均優(yōu)于同期生理鹽水組，Tb.Ar%在8、12周均明顯高于同期生理鹽水組（P＜0.05），進(jìn)一步說(shuō)明青娥方能有效地抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能，減少對(duì)骨基質(zhì)的吸收破壞，發(fā)揮護(hù)骨的作用。

綜上所述，中藥青娥方可以通過(guò)降低血清MMP-9、TRACP5b、Cath-K的含量，來(lái)抑制破骨細(xì)胞的功能活性，減少對(duì)骨基質(zhì)的吸收破壞，最終發(fā)揮護(hù)骨強(qiáng)骨之功。

［1］ 劉獻(xiàn)祥，林燕萍，蘇友新.骨質(zhì)疏松性骨折［M］.福州：福建科學(xué)技術(shù)出版社，2008：145.

［2］ TEITELBAUM S L.Bone resorption by osteoclasts ［J］.Science，2000，289（5484）：1504-1508.

［3］ TEZUKA K，NEMOTO K，TEZUKA Y，et al.Identification of matrix metalloproteinase 9 in rabbit osteoclasts ［J］.J Biol Chem，1994，269（21）：15006-15009.

［4］ 秦健，楊乃龍.絕經(jīng)后婦女血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1與骨密度的關(guān)系［J］.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2008，14（4）：245-248.

［5］ BOLTON C E，STONE M D，EDWARDS P H，et al.Circulating matrix metalloproteinase-9 and osteoporosis in patients with chronic obstructive pulmonary disease ［J］.Chron Respir Dis，2009，6（2）：81-87.

［6］ 薛延，張海文，楊立紅，等.血清骨特異性酸性磷酸酶的臨床意義［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2003，19（6）：466-467.

［7］ 孫雨晴，羅文娟，王柄棋，等.青娥方對(duì)卵巢切除大鼠骨組織骨橋蛋白、骨唾液蛋白及其受體整合素αVβ3表達(dá)的影響［J］.康復(fù)學(xué)報(bào)，2017，27（3）：23-30.

［8］ HWANG J S，TU S T，YANG T S，et al.Teriparatide vs.calcitonin in the treatment of Asian postmenopausal women with established osteoporosis ［J］.Osteoporos Int，2006，17（3）：373-378.

［9］ HALLEEN J M，TIITINEN S L，YLIPAHKALA H，et al.Tartrateresistant acid phosphatase 5b （TRACP 5b） as a marker of bone resorption ［J］.Clin Lab，2006，52（9-10）：499-509.

［10］ YANG J，SHANG G D，ZHANG Y Q.Study of a novel antiosteoporosis screening model targeted on cathepsin K ［J］.Biomed Environ Sci，2004，17（3）：273-280.

［11］ RAVIKUMAR M，PAVAN S，BAIRY S，et al.Virtual screening of cathepsin k inhibitors using docking and pharmacophore models ［J］.Chem Biol Drug Des，2008，72（1）：79-90.

［12］曾廣智，譚寧華，賈銳銳，等.組織蛋白酶及其抑制劑研究進(jìn)展［J］.植物分類(lèi)與資源學(xué)報(bào)，2005，27（4）：337-354.

［13］ BERDOWSKA I.Cysteine proteases as disease markers ［J］.Clin Chim Acta，2004，342（1-2）：41-69.

［14］ ISHIKAWA T，KAMIYAMA M，TANI-ISHII N，et al.Inhibition of osteoclast differentiation and bone resorption by cathepsin K antisense oligonucleotides ［J］.Mol Carcinog，2001，32（2）：84-91.

［15］ SWAMINATHAN R.Biochemical markers of bone turnover ［J］.Clin Chim Acta，2001，313（1-2）：95-105.

［16］ LEGRAND J J，F(xiàn)ISCH C，GUILLAUMAT P O，et al.Use of biochemical markers to monitor changes in bone turnover in cynomolgus monkeys ［J］.Biomarkers，2003，8（1）：63-77.