高效液相色譜法測(cè)定活血散中芍藥苷的含量

陳麗艷

（福建省福州市食品藥品檢驗(yàn)所，福建 福州 350007）

活血散是福州市盤(pán)嶼中醫(yī)骨科醫(yī)院的自制藥品，由乳香、沒(méi)藥、赤芍等十幾味中藥經(jīng)加工制成，具有舒筋活絡(luò)、活血化瘀、行氣消腫止痛的功效，用于治療傷筋及骨折腫痛等。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)。赤芍為活血散的主藥，在處方中起祛瘀止痛、涼血消腫之功效，其有效成分為芍藥苷［1］。為了更好地控制該制劑質(zhì)量，本文參考有關(guān)資料［2］，采用高效液相色譜法建立了活血散中芍藥苷的含量測(cè)定，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 島津LC-20A高效液相色譜系統(tǒng)（紫外檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱）（日本島津公司）；KQ-500WDE三頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）；Milli-Q-Reference超純水機(jī)（法國(guó)密理博公司）；BP211D電子天平（北京賽多利斯公司）。

1.2 試藥與試劑 芍藥苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110736-201640，含量 96.4%）。乙腈為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純；活血散3批（福州市盤(pán)嶼中醫(yī)骨科醫(yī)院，批號(hào)：161201、161203、161204）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：C18ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（14∶86），流速：1.0 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品的制備 精密稱取芍藥苷對(duì)照品20.24 mg，置50 mL棕色量瓶中，加稀乙醇溶解，制成0.39 mg／mL的溶液，作為對(duì)照品貯備液。精密吸取該貯備液5 mL置50 mL量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品，混勻，取約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲（250 W，33 kHz）1 h，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，取上清液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 根據(jù)處方制備不含赤芍的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制得活血散陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性考察 取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液按“2.1項(xiàng)”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1～圖3。結(jié)果顯示供試品中芍藥苷分離度好（分離度大于1.5），陰性溶液無(wú)干擾。

2.4 線性范圍 精密量取“2.2.1項(xiàng)”下的芍藥苷對(duì)照品貯備液，用稀乙醇稀釋成 3.90、7.80、19.51、39.02、58.53、78.04 μg／mL 梯度濃度溶液，分別進(jìn)樣20 μL。以芍藥苷峰面積對(duì)溶液濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A＝2.595×104C－1.006×104，r＝0.9996。可見(jiàn)芍藥苷溶液濃度在3.90～78.04 μg／mL范圍內(nèi)具良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次 20 μL，記錄峰面積，RSD＝1.52%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液，每隔2 h進(jìn)樣1次，共進(jìn)樣6次，記錄峰面積，RSD＝1.52%，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)供試品溶液在12 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)（批號(hào)161201）活血散樣品，共6份，按“2.2.2項(xiàng)”的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果芍藥苷的平均含量為1.70 mg／g，RSD＝1.85%。

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn) 取同一批，6份已知含量的活血散0.75 g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入一定量芍藥苷對(duì)照品，按“2.2.2項(xiàng)”供試品含量測(cè)定法依法測(cè)定，計(jì)算回收率。見(jiàn)表1。

2.9 樣品測(cè)定 取3批樣品，按“2.2.2項(xiàng)”的方法制備供試品溶液，按“2.1項(xiàng)”的色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定芍藥苷含量，見(jiàn)表2。

3 討 論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 根據(jù)主要成分的紫外吸收光譜，芍藥苷在波長(zhǎng)230 nm處有最大吸收，在這一波長(zhǎng)下測(cè)定，樣品中其他化學(xué)成分未見(jiàn)干擾，故本實(shí)驗(yàn)采用230 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

注：A芍藥苷。

圖2 供試品HPLC色譜圖

圖3 陰性樣品HPLC色譜圖

表1 芍藥苷回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 3批活血散樣品測(cè)定結(jié)果（n＝3）

3.2 流動(dòng)相的選擇 比較3種不同流動(dòng)相，A：乙腈-0.1%磷酸（14∶86），B：甲醇-水（15∶85），C：乙腈-水（15∶85），選擇流動(dòng)相 A，芍藥苷峰形對(duì)稱，與其他成分峰分離良好。

3.3 提取方法的選擇 比較回流提取與超聲波提取，二者差別不大。考慮到超聲波提取操作簡(jiǎn)單，受熱溫度低，故選擇超聲波提取；曾以甲醇、稀乙醇及水超聲提取，結(jié)果表明稀乙醇提取芍藥苷含量最高，因此采用稀乙醇提取；考察了不同時(shí)間提取效果，發(fā)現(xiàn)1 h提取率最高，故選擇超聲1 h。

［1］ 陸小華，馬驍，王建，等.赤芍的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展［J］.中草藥，2015，46（4）：595-602.

［2］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：462.