大白菜抗根腫病的抗源篩選和分子標記鑒定

朱明釗 張淑江 張 慧 章時蕃 李 菲 王曉武 武 劍 李國亮魏云曉 岳麗昕 孫日飛

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

大白菜根腫病是由蕓薹屬根腫菌（Plasmodiophora brassicaeWoron.）侵染引起的專性寄生的世界性土傳病害，主要危害十字花科作物，最早發現于地中海西岸和歐洲南部，現在許多國家都有發生（楊永林，1990）。根腫菌的休眠孢子可以在土壤中存活7 a以上（Karling，1968），因此，田間一旦受到污染，將長期不再適合十字花科作物的種植。通過田間管理和生物化學防治的方法不能從根本上防治根腫病，選育抗根腫病的大白菜新品種是最經濟有效的方法（Kuginuki et al.，1999）。

迄今為止，在大白菜中至少有12個抗根腫病基因被定位出來，其中Crr2位于A01連鎖群（Suwabe et al.，2003），CRc位 于 A02連 鎖 群（Sakamoto et al.，2008），CRa、CRb、CRbkato、CRk、Crr3、PbBa3.1、PbBa3.3和Rcr1都位于A03連鎖群（Hirai et al.，2004；Piao et al.，2004；Sakamoto et al.，2008；Matsumoto et al.，2012；Chen et al.，2013；Kato et al.，2013；Chu et al.，2014），Crr4位于 A06連鎖群（Suwabe et al.，2006），Crr1位于A08連鎖群（Suwabe et al.，2003）；另外，Gao等（2014）將1個抗病基因定位到了與CRa相同的位置（Ueno et al.，2012），該基因可能與CRa是同一基因；王彤彤等（2012）將1個抗病基因定位到了A08連鎖群并證明了該基因與Crr1不在同一區域，是一個新的抗病基因。

以往的基因定位工作只能定位1個或2個抗病基因，而對根腫菌分化的眾多的生理小種，單個基因往往不起作用，因此，將多個抗病基因聚合到同一份材料當中是提高材料抗病的廣泛性和耐久性的有效方法（Matsumoto et al.，2012；Hatakeyama et al.，2017）。本試驗以根腫菌M01、M02和M03為病原菌菌源，對24份大白菜材料進行接種鑒定和分子標記鑒定，旨在篩選出抗多個根腫菌的抗源，并明確與之相關的抗病基因，以期為今后抗根腫病聚合育種工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試24份大白菜材料（表1）保存于中國農業科學院蔬菜花卉研究所白菜課題組，以感病大白菜作為對照。供試根腫菌M01、M02和M03分別采自遼寧沈陽、云南昆明和河南鄭州，根腫病菌根置于-20 ℃冰箱中保存備用。

表1 材料名稱及來源

1.2 接種方法

1.2.1 菌液的制備 2017年3月8日在中國農業科學院蔬菜花卉研究所實驗樓406進行，制備方法在Kawamura等（2017）的基礎上進行了改進，取20 g保存于-20 ℃冰箱的根腫病菌根，室溫下解凍后加入200 mL蒸餾水于攪拌器中攪碎，8層紗布過濾，濾液于4℃、4 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，用無菌水懸浮沉淀，用血球計數板將濃度調至2×107個·mL-1，4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 接種 2017年3月在本所南圃場春化室進行，采用浸根法（柴阿麗 等，2015）接種。3月2日在鋪有單層濾紙的培養皿中對大白菜種子進行催芽，6 d后將根系浸入配制好的根腫菌懸浮液中，30 min后將幼苗栽入提前裝好基質并灌透底水的50孔穴盤中，每穴1株，每處理6穴，3次重復。42 d后進行病情調查。

1.3 病情調查

病 情 分 級 標 準 參 考 Kuginuki等（1999）、Suwabe等（2006）、Kato等（2013）的方法：0級，根部無腫大現象；1級，側根根部有少量小腫瘤；2級，側根根部有較大腫瘤或主根上有小腫瘤；3級，主根和側根都出現嚴重的腫大（圖1）。

病情指數計算及抗性評價標準參考Zhang等（2015）的方法：抗?。≧），病情指數≤26；感?。⊿），病情指數＞26。

病情指數=Σ（各病級株數×相應級數）/（調查總株數×3）×100

圖1 根腫病病情分級標準

1.4 數據分析

采用SPSS軟件對調查結果進行單因素方差分析：① 針對每1份材料對3種根腫菌的抗性表現進行方差分析；② 分別計算出24份材料對3種根腫菌病情指數的平均值，然后進行方差分析。

1.5 分子鑒定

1.5.1 DNA的提取 采集24份大白菜材料的幼嫩葉片，采用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法（Murray & Thompson，1980）提取單株DNA，用Nanodrop 2000分光光度計測定DNA濃度。

1.5.2 分子標記檢測 對24份大白菜材料進行分子標記鑒定，共用到22個標記，涉及10個基因。其中，標記HC352b-SCAR、SC2930-T-FW/-RV、SC2930-Q-FW/-RV、CRaim-T與 基 因CRa連 鎖（Hayashida et al.，2008；Matsumoto et al.，2012；Ueno et al.，2012），標記 TCR05、TCR09、TCR79、TCR108、K-3與 基 因CRb連 鎖（Piao et al.，2004；Zhang et al.，2014；Chen et al.，2016）， 標記KBrH129J18R與基因CRbkato連鎖（Kato et al.，2013）， 標 記 B50-C9-FW/-RV、B50-6R-FW/-RV與 基 因CRc連 鎖（Matsumoto et al.，2012）， 標記 HC688-4-FW/-6-RV、HC688-4-FW/-7-RV與基 因CRk連 鎖（Matsumoto et al.，2012）， 標 記BRMS-088和BRMS-096分別與基因Crr1和Crr2連鎖（Suwabe et al.，2003），標記OPC11-2S與基因Crr3連鎖（Saito et al.，2006），標記M8、M9、M10與基因CR-A3連鎖（Gao et al.，2014），標記BrID11683、BrID90269與1個尚未定位的基因連鎖（王彤彤 等，2012）。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴增體系為10 μL：PCR mix 5 μL，1.0 μmol·L-1上下游引物各0.2 μL，50 ng·L-1模板 DNA 2 μL，ddH2O 補齊至10 μL。PCR擴增片段長度≥600 bp的標記利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，PCR擴增片段長度＜600 bp的標記利用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。

2 結果與分析

2.1 接種鑒定

從圖2可以看出，感病對照CK對3種根腫菌都表現感病，說明本試驗采用的接種方法準確可靠。24份大白菜材料中，有10份抗病材料，14份感病材料。其中，材料CR004、CR007、CR013、CR015和CR016對3種根腫菌都表現抗病，材料CR012、CR014和CR018對根腫菌M01和M02表現抗病，材料CR021只對根腫菌M01表現抗病，材料CR023只對根腫菌M02表現抗病。3個根腫病小種對24份大白菜材料平均病情指數的單因素方差分析結果表明：根腫菌M01和M02在24份材料中的致病力差異不顯著，根腫菌M03在24份材料中的致病力與M01和M02差異顯著，從材料CR014、CR017和CR018的表現也可以看出，根腫菌M01和M02之間的致病力差異不顯著，而根腫菌M03的致病力與M01、M02差異顯著。

圖2 不同大白菜材料對3種根腫菌的抗性鑒定結果

表2 不同大白菜材料的根腫病抗性及對應的抗性基因

2.2 分子標記鑒定

鑒定結果表明，本試驗用到的22個分子標記中只有10個具有多態性，分別是SC2930-T-FW/-RV、SC2930-Q-FW/-RV、KBrH129J18R、B50-C9-FW/-RV、B50-6R-FW/-RV、HC688-4-FW/-6-RV、HC688-4-FW/-7-RV、BRMS-088、BRMS-096和OPC11-2S，共涉及7個基因，分別是CRa、CRbkato、CRc、CRk、Crr1、Crr2和Crr3。

由表2可以看出，感病材料中有的不含抗病基因，有的含有抗病基因CRk、Crr1或Crr2。材料CR012、CR014和CR018對根腫菌M01和M02表現出抗性，其中CR012含有基因抗病基因CRa和CRbkato，CR014和CR018含有抗病基因CRa、CRbkato和CRk； 材 料 CR004、CR007、CR013、CR015和CR016對根腫菌M01、M02和M03表現出抗性，其中CR004和CR007只含有抗病基因CRk，CR013含有抗病基因CRa、CRbkato、CRk和Crr3，CR015和CR016含有抗病基因CRa、CRbkato和Crr3；材料CR021只抗根腫菌M01且含有抗病基因Crr2和CRk，材料CR023只抗根腫菌M02且含有抗病基因CRc和CRk。

3 結論與討論

明確根腫菌各生理小種在我國不同地區的分布，對提高抗病品種選育的效率具有非常重要的意義。根腫菌存在生理小種的分化，目前已經鑒定出的生理小種超過24個（孫保亞 等，2005）。我國主要的生理小種有2號、4號、7號、10號和11號，其中以4號生理小種為主（沈向群 等，2009；丁云花 等，2013）。彭沙莎等（2013）鑒定出湖南大白菜根腫菌生理小種有1號、4號、9號和13號；劉峰等（2013）鑒定出云南和西藏大白菜根腫菌生理小種有1號、2號、4號、6號、7號、10號、11號和12號；李寧等（2015）鑒定出陜西太白縣根腫菌生理小種為7號。因此，明確抗源對不同生理小種或不同地區生理小種的抗性對育種工作十分重要。

分子標記在輔助選擇育種、遺傳多樣分析和基因定位及克隆等方面的應用具有十分明顯的優越性（McCouch et al.，1997；Liu et al.，2013）。孫保亞等（2005）從國外引進的大白菜品種中分離出48個抗根腫病大白菜自交系；樸鐘云等（2010）通過分子標記輔助選擇的方法加速回交選育，培育出大白菜優良自交系BJN3的9份抗根腫病近等基因系。Matsumoto等（2012）利用分子標記輔助選擇和傳統育種相結合的方法實現了3個抗根腫病基因CRa、CRc和CRk的聚合，并證明了聚合之后作物的抗病能力有所加強。本試驗中，抗病基因CRk、Crr1和Crr2也存在于感病材料中，筆者推測這3個基因對材料的抗病性沒有貢獻。材料CR012、CR014和CR018對根腫菌M01和M02表現出抗性，其中CR012含有抗病基因CRa和CRbkato，CR014和CR018含有抗病基因CRa、CRbkato和CRk，由此推測材料對M01和M02的抗性可能與CRa或CRbkato有關，也可能與兩者都有關。材料CR013、CR015和CR016對根腫菌M01、M02和M03都表現出抗性，其中CR013含有抗病基因CRa、CRbkato、CRk和Crr3，CR015和CR016含有抗病基因CRa、CRbkato和Crr3，推測基因Crr3對M03具有特異抗性。材料CR023只抗根腫菌M02且含有抗病基因CRc和CRk，因此認為基因CRc可能對M02具有特異抗性。CR004、CR007和CR021是3份比較特殊的材料，其中CR004和CR007對根腫菌M01、M02和M03都表現出抗性但只含有抗病基因CRk，CR021只抗根腫菌M01且含有抗病基因Crr2和CRk；由于本試驗感病材料中也含有基因Crr2和CRk，因此推測這3份材料中可能還含有其他抗病基因，有待進一步研究。

本試驗對24份大白菜材料進行接種鑒定，首次明確了它們對3個不同地區根腫菌的抗性，并篩選出10份抗病材料。同時，利用已經開發出的與抗病基因連鎖的分子標記對24份材料進行了分子鑒定，明確了與材料抗病性相關的基因，對今后抗病材料的篩選和抗病基因的分子聚合育種具有較高的參考價值。

柴阿麗，朱發娣，王惟萍，石延霞，謝學文，李寶聚．2015．十字花科根腫病接種技術及發病條件研究．華北農學報，（S1）：266-271．

丁云花，簡元才，余陽俊，汪維紅，耿麗華，康俊根．2013．我國8省市十字花科蔬菜根腫菌生理小種的鑒定．中國蔬菜，（16）：85-88．

李寧，趙利民，魚昭君，陳紅紅，惠麥俠．2015．大白菜品種對陜西省太白縣根腫病的抗性鑒定．中國農學通報，31（34）：173-176．

劉峰，張麗輝，姬廣海．2013 ．云南和西藏十字花科蔬菜根腫菌生理小種鑒定．中國蔬菜，（20）：77-78．

彭沙莎，任佐華，黃小莉，劉敏捷，孫良菲，劉二明．2013．湖南十字花科作物根腫菌生理小種鑒定．長江蔬菜，（6）：46-49．

樸鐘云，吳迪，王淼，張騰．2010．大白菜抗根腫病近等基因系的分子標記輔助選育．園藝學報，37（8）：1264-1272．

沈向群，聶凱，吳瓊，張玉光，孟星河．2009．大白菜根腫病主要生理小種種群分化鑒定初報．中國蔬菜，（8）：59-62．

孫保亞，沈向群，郭海峰，周永紅．2005．十字花科植物根腫病及抗病育種研究進展．中國蔬菜，（4）：34-37．

王彤彤，張淑江，章時蕃，李菲，張慧，孫日飛．2012．大白菜根腫病抗性基因的標記和定位．中國蔬菜，（14）：31-35．

楊永林．1990．十字花科蔬菜根腫病抑菌型土壤初探．植物保護學報，17（2）：127-131．

Chen J，Jing J，Zhan Z．2013．Identification of novel QTLs for isolatespecific partial resistance toPlasmodiophora brassicainBrassica rapa．PLoS One，8（12）：e85307．

Chen L，Zhang X，Xu H．2016．Introgression of clubroot resistance into an elite pak choi inbred line through marker-assisted introgression breeding．Plant Breeding，135（4）：471-475．

Chu M，Song T，falk K，Zhang X，Liu X，Chang A．2014．Fine mapping ofRcr1and analyses of its effect on transcriptome patterns during infection byPlasmodiophora brassicae．BMC Genomics，10.1186/1471-2164-15-1166．

Gao F，Hirani A H，Liu J，Liu Z，Fu G，Wu C，Peter B E，McVetty P B E，Li G．2014．Fine mapping a clubroot resistance locus in Chinese cabbage．J Amer Soc Hort Sci，139（3）：247-252．

Hatakeyama K，Niwa T，Kato T，Ohara T，Kakizaki T，Matsumoto S．2017．The tandem repeated organization of NB-LRR genes in the clubroot-resistantCRblocus inBrassica rapaL．Molecular Genetics and Genomics．292（2）：397-405．

Hayashida N，Takabatake Y，Nakazawa N．2008．Construction of a practical SCAR marker linked to clubroot resistance in Chinese cabbage，with intensive analysis ofHC352bgenes．Journal of the Japanese Society for Horticultural Science，77（2）：150-154．

Hirai M，Harada T，Kubo N，sukada M，Suwabe K，Matsumoto S．2004．A novel locus for clubroot resistance inBrassica rapaand its linkage markers．Theoretical and Applied Genetics，108（4）：639-643．

Karling J S．1968．The plasmodiophorales：including a complete host index，bibliography，and a description of diseases caused by species of this order．Molecular Biology & Evolution，22（3）：582-588．

Kato T，Hatakeyama K，Fukino N，Matsumoto S．2013．Fine mapping of the clubroot resistance geneCRband development of a useful selectable maker inBrassica rapa．Breeding Sci，6（3）：116-124．

Kawamura K，Shimizu M，Kawanabe T．2017．Assessment of DNA markers for seed contamination testing and selection of disease resistance in cabbage．Euphytica，213（1）：28．

Kuginuki Y，Yoshikawa H，Hirai M．1999．Variation in virulence ofPlasmodiophora brassicaein Japan tested with clubrootresistant cultivars of Chinese cabbage（Brassica rapaL．ssp. pekinensis）．European Journal of Plant Pathology，105（4）：327-332．

Liu B，Wang Y，Zhai W，Deng J，Wang H，Cui Y，Cheng F，Wang X W，Wu J．2013．Development of InDel markers forBrassica rapabased on whole-genome re-sequencing．Theoretical and Applied Genetics，126（1）：231-239．

Matsumoto E S，Ueno H S，Aruga D．2012．Accumulation of three clubroot resistance genes through marker-assisted selection in Chinese cabbage（Brassica rapassp. pekinensis）．Journal of the Japanese Society for Horticultural Sciences，81（2）：184-190．

McCouch S R，Chen X，Panaud O．1997．Microsatellite marker development，mapping and applications in rice genetics and breeding．Plant Molecular Biology，35：89-99．

Murray M G，Thompson W F．1980．Rapid isolation of high-molecular weight plant DNA．Nucleic Acids Research，8：4321-4325．

Piao Z Y，Deng Y Q，Choi S R．2004．SCAR and CAPS mapping ofCRb，a gene conferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage（Brassica rapassp. pekinensis）．Theoretical and Applied Genetics，108（8）：1458-1465．

Saito M，Kubo N，Matsumoto S，Suwabe K，Tsukada M，Hirai M．2006．Fine mapping of the clubroot resistance gene，crr3，inBrassica rapa．Theor Appl Genet，114：81-91．

Sakamoto K，Saito A，Hayashida N，Taguchi G，Matsumoto E．2008．Mapping of isolate-specific QTLs for clubroot resistance in Chinese cabbage（Brassica rapaL. ssp. pekinensis）．Theoretical and Applied Genetics，117（5）：759-767．

Suwabe K，Tsukazaki H，Lketani H．2003．Identification of two loci for resistance to clubroot（Plasmodiophoru brassicaeWorenin）inBrassica rapaL．Theoretical and Applied Genetics，107（6）：997-1002．

Suwabe K，Tsukazaki H，Iketani H，Hatakeyama K，Kondo M，Fujimura M，Nunome T，Fukuoka H，Hirai M，Matsumoto S．2006．Simple sequence repeat-based comparative genomics betweenBrassica rapaandArabidopsis thaliana：the genetic origin of clubroot resistance．Genetics，173（1）：309-319．

Ueno H，Matsumoto E，Aruga D，Kitagawa S，Matsumura H，Hayashida N．2012．Molecular characterization of theCRagene conferring clubroot resistance inBrassica rapa．Plant Mol Biol，80：621-629．

Zhang T，Zhao Z，Zhang C．2014．Fine genetic and physical mapping of theCRbgene conferring resistance to clubroot disease inBrassica rapa．Molecular Breeding，34（3）：1173-1183．

Zhang H，Feng J，Zhang S．2015．Resistance toPlasmodiophora brassicaeinBrassica rapaandBrassica junceagenotypes from China．Plant Disease，99（6）：776-779．