一例豬藍耳病繼發感染副豬嗜血桿菌的診斷及防治

劉 杰，李英英，孫 哲，劉維康，劉守川，趙坤坤

（洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司，河南 洛陽 471000）

2017年5月洛陽某豬場保育豬出現咳嗽，喘氣、關節腫大等癥狀。對3頭發病豬進行剖檢，取病變組織進行病原學鑒定，結果檢測出豬藍耳病毒、副豬嗜血桿菌。結合臨床癥狀、病理變化和實驗室診斷，確診為豬藍耳病繼發副豬嗜血桿菌。

1 材料與方法

1.1 臨床情況及取樣

某豬場保育豬出現咳嗽，喘氣，關節腫大等癥狀，發病率30%，死亡率20%。選取3頭有發熱、咳嗽并伴跛行等癥狀的病豬進行剖檢。剖檢可見心包積液增多、呈淡黃色，肺臟邊緣有黃色纖維素性滲出物，肺臟尖葉和心葉出現實變，關節積液增多，顏色微黃（圖1）。根據臨床癥狀及病理情況分別采集扁桃體、肺臟等組織進行病原檢測和細菌分離。

1.2 主要培養基及試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA），由青島海博試劑有限公司提供；革蘭氏染色試劑， 購自北京索萊寶科技有 限 公 司；DNA Taq酶、dNTPs、DNAmarker等購自寶生物（大連）工程有限公司；細菌微量生化管及藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；病毒核酸提取試劑盒，購自臺灣旭基。

1.3 方法

1.3.1 病毒樣品處理

取肺臟和扁桃體健康部位與病變部位的交界處0．5 g置于滅菌平皿內，用眼科剪剪碎，置于玻璃研磨器中，并加入約1 mL滅菌PBS進行研磨。將已研磨好的組織樣品勻漿液轉入15 mL滅菌離心管中用滅菌的PBS定容至5 mL，取1mL至1．5 mL滅菌離心管中，液氮及室溫反復凍融3次。

1．3．1．1 病毒 RNA 提取

取組織研磨液，8 000 r/min離心2 min，取上清液作為待檢樣品。分別取待檢樣品、陽性對照和陰性對照各200μL，按照病毒核酸提取試劑盒說明書進行核酸的提取。

1．3．1．2 cDNA 的制備

根據試劑盒說明書進行RTPCR擴增。反應程序為25 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，20 ℃ 1 min，之后保存。

RT-PCR采 用20μL反 應 體系， 即 2×ES Reaction Mix 10μL，EasyscriptRT/RI Enzyme mix 1μL，隨機引物1μL，RNA模板8μL。

圖1 剖檢圖片

1.3.2 細菌分離

無菌采取病死豬肺臟，分別接于含TSA+血清培養基、血平板和TSA+血清+NAD培養基，37 ℃，厭氧培養24 h，觀察菌落形態，挑取單個菌落進行純化培養，純化培養后菌株進行革蘭氏染色鏡檢和常規細菌生化試驗。

1.3.3 分子鑒定

根據豬藍耳病毒序列，參照GenBank PRRSV的全基因序列中的ORF7末端序列設計了一對特異性的引物，序列為：5’-GAA TGG CCA GCC AGT CAA TC-3’， PRRSV-436R ：5’-GTC GCC CTA ATT GAA TAG GTG AC-3’，擴增出目的片段大小為436 bp，該引物由英濰捷基（北京）貿易有限公司合成。

PCR采用25μL反應體系，即10×PCRBuffer2．5μL、dNTP 2．0μL、DNA Taq 酶 0．5μL，PRRSV-436F/ PRRSV-436R 引 物 各 1．0μL，DNA 模 板 2．0μL，ddH2O 16．0μL。PCR反 應 條 件 為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 共30個循環；72 ℃ 10 min，20 ℃ 1 min后保存。PCR產物經1．5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

根據副豬嗜血桿菌16S rRNA基因，張盼峰等[1]設計了一對特異性引物，引物序列為：P1：5’-GGC TTC GTC ACC CTC TGT-3’，P2：5’-GTG ATG AGG AAG GGT GT-3’，擴增出的目的片段大小為821 bp，該引物由英濰捷基（北京）貿易有限公司合成。

PCR采 用25μL反 應 體系， 即 10×PCRBuffer2．5μL、dNTP 2．0μL、DNA Taq 酶 0．5μL，P1/P2引 物 各 1．0μL，DNA 模 板2．0μL，ddH2O 16．0μL。PCR 反應條件為 ：94 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，共 30 個循環 ；72 ℃ 10 min。PCR 產物經1．5% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.4 ERIC-PCR指紋圖譜分析

參照M RAFIEE等[2]報道提供的引物進行分析，引物序列為：ERI C-1R：5’-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3’，ERIC-2：5’-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3’。

PCR采 用25μL反 應 體系， 即 10×PCRBuffer2．5μL、dNTP 2．0μL、DNA Taq 酶 0．5μL，上 下 游 引 物 各 1．0μL，DNA 模 板2．0μL，ddH2O 16．0μL。PCR 反應 條 件 為：95 ℃ 2 min，94℃ 30 s，50 ℃30 s，72 ℃6 min，共30個循環；72 ℃6 min。PCR產物經1．5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.5 衛星試驗及生化鑒定

取一塊沒有添加NAD的TSA血清平皿，在平板中間沿直徑線涂劃接種金黃色葡萄球菌，然后將疑似菌落垂直金黃色葡萄球菌線劃線接種，37 ℃，培養24 h后觀察是否出現靠近金黃色葡萄球菌線的菌落長勢較好，遠離金黃色葡萄球菌線的地方無菌落生長的衛星現象。

選取生化鑒定試管進行試驗，特別注意在進行生化鑒定時，需要在生化鑒定管內添加適量NAD。

1.3.6 藥敏試驗

挑取疑似單個菌落接種于TSB+血清+NAD培養基，置于37 ℃恒溫搖床中，培養5～6 h，取100μL均勻涂布于含TSA+血清+NAD培養基上。用紙片瓊脂擴散法（K-B法）[3]進行藥敏試驗，選取頭孢噻呋、阿莫西林、甲砜霉素、硫酸黏菌素、阿米卡星、恩諾沙星、卡那霉素、慶大霉素、多西環素和氟苯尼考為試驗藥物，37 ℃培養16～18 h后，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小，根據說明書敏感和耐藥性的最小抑菌圈直徑判定菌株對所選藥物的敏感程度。

2 結果

2.1 細菌分離結果

菌落形態為圓形隆起、表面光滑、邊緣整齊、小而透明的菌落（圖2），革蘭氏染色為陰性桿菌（圖3）。

圖2 菌落形態

圖3 革蘭氏染色鏡檢（1 000×）

2.2 分子鑒定結果

從豬藍耳病毒分子鑒定電泳圖結果（圖4），可以看到在第2、3泳道出現430 bp左右的特異性條帶，與我們設計引物擴增的藍耳病病毒基因片段長度相符。

取單個純化且具有典型特點的菌落 進行PCR鑒定，并設陽性和陰性對照，陽性對照電泳結果條帶大小為821 bp左右，樣品條帶大小也為821 bp左右，陰性對照無條帶，根據結果判定為副豬嗜血桿菌，結果如圖5。

圖4 藍耳病毒分子鑒定結果

圖5 副豬嗜血桿菌分子鑒定結果

2.3 ERIC-PCR指紋圖譜結果分析

分離菌株進行ERIC-PCR指紋圖譜分析，如圖6，將得到的ERIC-PCR指紋圖譜與學者Rafiee等發表的15種標準血清型的指紋圖譜進行比對，結果發現分離菌株的圖譜與血清型5型的圖譜高度相似，并進行血清型驗證，鑒定結果為血清型5型。

圖6 ERIC-PCR結果

2.4 衛星試驗及生化鑒定結果

從圖7可看出，分離株在靠近金黃色葡萄球菌直線處生長較好，而遠離金黃色葡萄球菌的地方基本沒有細菌生長。

從表1不難看出，分離到的菌株不發酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖，氧化酶和尿素酶陰性，硝酸鹽還原酶和接觸酶陽性，靛基質和VP試驗陰性。與副豬嗜血桿菌的生化特性一致。

2.4 藥敏試驗結果

挑取分離到的副豬嗜血桿菌進行藥敏試驗，敏感藥物為頭孢噻呋、甲砜霉素、硫酸黏菌素、阿米卡星、恩諾沙星、卡那霉素、慶大霉素、多西環素和氟苯尼考。

表1 生化鑒定結果

表2 藥敏試驗結果

3 總結

本次檢測結果為豬藍耳病毒陽性，副豬嗜血桿菌血清型5型陽性，根據其發病機理判斷為豬藍耳病繼發副豬嗜血桿菌。豬藍耳病是一種免疫抑制類疾病，尚無有效的治療措施，對其防治應從以下幾個方面進行。1)引種傳播是其傳播的重要途徑，因此應堅持自繁自養，不從疫區和有過該病發病史的豬場引種是一種重要的預防措施 。2)嚴格控制豬舍環境，要嚴格執行消毒制度，建立無毒清潔豬場，另外加強飼養管理，及時調整豬群飼養密度，改善豬舍通風采光，病毒的穩定性受pH和溫度的影響較大，在pH小于5或大于7時，其感染力降低95%以上，豬舍內可用pH較低的消毒液采用疫病期間的用藥劑量帶豬噴霧消毒，包括豬舍內的用具每天徹底消毒。3)做好豬藍耳病免疫接種工作，商品仔豬在斷奶之后進行初次免疫，每頭豬2 mL，在疫情暴發地區在初次免疫后30 d采用相同劑量進行一次加強免疫，后備種豬在150日齡再次進行免疫，每頭豬4 mL，母豬和種公豬每隔4個月進行免疫1次，每次每頭4 mL。4)一旦豬場發病，要盡快將病豬隔離治療，而且主要從兩個方面進行，一個方面是提高發病豬只的抵抗力，添加如黃芪多糖和復方花青素以增強畜體抗病毒、細菌感染的抵抗力，另一方面是使用抗生素，緩解癥狀和防止繼發感染，如將泰樂菌素、磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐氨嘧啶拌入飼料。5)建立免疫檔案，做好疫病監測，定期對免疫豬進行抗體檢測，并根據抗體水平高低及時加強免疫，一般每季度監測1次，對各階段的豬群進行采樣抗體監測，根據監測結果進行免疫效果及疫情分析。

副豬嗜血桿菌的防治，需要加強主要病毒性疾病的免疫、選擇有效的藥物組合對豬群進行常規的預防保健、改善豬群飼養管理等。對于副豬嗜血桿菌的治療應從兩方面進行，一是注射抗生素，通過藥敏試驗篩選出敏感藥物，結合臨床情況，選擇合適藥物。二是副豬嗜血桿菌和其他的革蘭氏陰性菌一樣可以產生內毒素，所以使用藥物時要充分考慮到內毒素的影響，否則會出現使用藥物后，癥狀不但不減輕反而加重的情況，因此通過在飼料中添加對內毒素有頡頏作用的黃芪多糖、淫羊藿等藥物[5]，以達到輔助治療的效果。

[1] 張盼鋒，仇微，劉宇，等． 副豬嗜血桿菌PCR快速診斷方法的建立[J]． 廣東畜牧獸醫科技 ，2009（1）：33-36．

[2] RAFIEE M， BARA M， STEPHENS C P ，e t a l．A p p l i c a t i o n o f ERIC PCR for the comparison of isolates of Haemophilus parasuis[J]． Australian Veterinary Journal，2001，78(12)：846-849．

[3] 譚瑤，趙清，舒為群，等．K-B紙片擴散法藥敏試驗[J]．檢驗醫學與臨床 ，2010，7（20）：2290-2291．

[4] 周雪瑞． 高致病性豬藍耳病及其防治[J]． 湖北農業科學 ， 2010， 49(5)：1153-1154．

[5] 王立新， 韓哲武． 黃芪多糖對內毒素致小鼠毒性損傷的作用[J]． 藥學學報，1992， 27(1)：5-9．