基于耐缺氧能力檢測的心腦寧膠囊質量控制方法研究

郭婷+董永喜+何峰+黃家宇+董莉

[摘要] 目的 建立可用于心腦寧膠囊質量控制的生物活性測定方法。方法 該次研究地點為貴州醫科大學藥學院，于2016年9月—2017年4月選擇健康昆明KM小鼠隨機分為6組，每組10只，即正常組、鹽酸異丙腎上腺素模型組、鹽酸川芎嗪陽性藥組以及心腦寧膠囊高、中、低劑量組。皮下注射鹽酸異丙腎上腺素 建立心肌缺氧模型（正常組注射生理鹽水）后，小鼠分別給予藥物鹽酸川芎嗪以及不同劑量的心腦寧膠囊，測定存活時間。并測定12批心腦寧膠囊的生物活性。結果 與模型組比較，心腦寧膠囊以0.68 g/kg、1.35 g/kg劑量給藥3 d后，可顯著增加缺氧小鼠的存活時間（P<0.05） ，分別增加21.42%、25.31%；且12批樣品均具有較好的生物活性，使小鼠存活時間增加24.74%以上（P<0.05）。結論 基于耐缺氧能力的心腦寧膠囊生物活性測定方法準確、可靠，能有效控制心腦寧膠囊的內在質量。

[關鍵詞] 心腦寧膠囊；耐缺氧能力；生物活性測定；質量控制

[中圖分類號] R286 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）12（b）-0012-04

[Abstract] Objective To establish the measurement method of biology activity of quality control of xinnaonign capsules. Methods 10 healthy Kunming KM mice in 6 group in our hospital from September 2016 to April 2017 were selected， including the normal group， isoproterenol hydrochloride mode group， and Ligustrazine Hydrochloride positive drug group and high-dose， moderate-dose and low-dose xinnaoning capsules group， and the mice was respectively given the ligustrazine hydrochloride and different doses of xinnaoning capsules after establishing the myocardial anoxia modes （injection of normal saline in the normal group）， and the survival time was measured， and the biology activities of 12 batches of xinnaoning capsules was measured. Results The administration of xinnaoning capsules of 0.68 g/kg and 1.35 g/kg for three days can obviously increase the survival time of hypoxia mice compared with that in the mode group（P<0.05）， and the increase values were respectively 21.42% and 25.31%， and 12 batches of samples had better biology activity， thus increasing the survival time of mice by more than 24.74%（P<0.05）. Conclusion The xinnaoning capsule based on the hypoxia-resistance ability test is accurate and reliable， which can effectively control the internal quality of xinnaoning capsules.

[Key words] Xinnaoning capsules； Hypoxia tolerance； Biochemical activity measurement； Quality control

心腦寧膠囊是治療心血管疾病的常用中藥復方制劑，由銀杏葉、小葉黃楊等配伍組成的，主要用于治療氣滯血瘀的胸痹，頭痛，眩暈，癥見：胸悶刺痛，心悸不寧，頭暈目眩等，以及冠心病、腦動脈硬化見上述癥狀者[1-3]。臨床療效顯著，受到廣大醫生和患者的歡迎。心腦寧膠囊在2015 年版《中國藥典》一部中的現行質量標準主要采用理化分析方法，對總黃酮醇苷和丹酚酸B進行含量測定，難以全面反映制劑的生物活性。中藥的生物活性是直接測定藥物有效性，是中藥質量控制中現有理化測定方法所不能替代的，近年來成為了中藥質量控制的熱點[4-5]。目前心腦寧膠囊的質量控制以薄層色譜定性鑒別和含量測定為主[6-7]，缺乏以生物活性為指導的質量控制方法，因此該實驗于2016年9月—2017年4月選擇健康KM小鼠60只選擇小鼠耐缺氧實驗對心腦寧膠囊進行生物活性測定方法的研究，建立其生物活性測定方法以控制產品的質量。

1 資料與方法

1.1 試劑與試藥

心腦寧膠囊（批號20141012），鈉石灰（批號2015 0618），鹽酸異丙腎上腺素注射液（ISO，批號20151102），注射用鹽酸川芎嗪（批號13090529）。

1.2 試驗動物

健康KM小鼠，18～22 g，雌雄各半，由貴州醫科大學實驗動物中心提供（合格證號SCXK（黔）2012-0001）。endprint

1.3 心腦寧膠囊對小鼠常壓耐缺氧能力限值劑量的研究

小鼠60只，雌雄各半，體重18～22 g。隨即分為6組，每組10只，分別為對照組、ISO模型組（15 mg/kg）、鹽酸川芎嗪組（40 mg/kg）、心腦寧膠囊高、中、低劑量組（1.35、0.68、0.34 g/kg），小鼠每天上午9：00灌胃給藥3 d，末次給藥后1 h，各組小鼠以15 mg/kg ISO皮下注射（正常組注射生理鹽水）， 20 min后，分測定小鼠存活時間并計算其增加率[8]。

1.4 重復性實驗

取心腦寧膠囊以1.35 g/kg劑量給藥，按1.3項下方法進行6次平行測定試驗，計算小鼠存活時間增加率。

1.5 中間精密度

1.5.1 不同實驗人員 對6 名實驗人員進行編號，稱取心腦寧膠囊6份均以1.35 g/kg劑量給藥，按1.3項下方法進行測定，計算小鼠存活時間增加率。

1.5.2 不同工作日（日間精密度） 稱取心腦寧膠囊6份均以1.35 g/kg劑量給藥，于第1天、第2天……第6天分別給藥，按1.3項下方法進行測定，計算小鼠存活時間增加率。

1.6 不同批次心腦寧膠囊生物活性的測定

分別取不同批號的12批心腦寧膠囊（1.35 g/kg），按1.3項下方法進行測定，計算小鼠存活時間增加率。

1.7 統計方法

采用 SPSS 18.0統計學軟件進行統計分析，計量結果以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用ANOVA分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 限值劑量研究

表1結果表明，與正常組比較，ISO模型組小鼠的存活時間顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，心腦寧膠囊以劑量0.68 g/kg、1.35 g/kg給藥3 d可明顯增加小鼠的存活時間（P<0.05），分別增加21.42%、25.31%。為保證實驗的可靠性和重復性，后期實驗中選用1.35g/kg劑量作為限值劑量進行試驗。

2.2 重復性實驗

同一樣品平行測定6次的結果，與模型組比較，心腦寧膠囊（1.35 g/kg）均可顯著增加小鼠的存活時間（P<0.05），增加率為22.71%～29.46%，表明重復性較好，見表2。

2.3 中間精密度

2.3.1 不同實驗人員 實驗室內不同的6 名實驗人員以1.35 g/kg心腦寧膠囊給藥3 d后進行測定，與模型組比較，心腦寧膠囊均可顯著增加小鼠的存活時間（P<0.05），增加率為25.35%～31.08%，表明不同實驗人員之間的中間精密度良好，見表3。

2.3.2 不同工作日（日間精密度） 按1.3項下方法，于第1天、第2天……第6天分別給藥心腦寧膠囊后進行測定，與模型組比較，6次試驗均可顯著增加小鼠的存活時間（P<0.05），增加率為22.39%～30.04%，表明方法的日間精密度良好。見表4。

2.4 不同批次心腦寧膠囊的生物活性測定

不同批號的12批樣品測定結果，與模型組比較，心腦寧膠囊均可顯著增加小鼠的存活時間（P<0.05），使小鼠存活時間增加24.74%以上，表明該方法適用性較好，見表5、表6。

3 討論

由于中藥成分復雜、來源多區域、有效成分不明確等特點，以薄層色譜鑒別、含量測定以及和指紋圖譜為主的現有質量標準就無法控制其藥效，具有一定的局限性[9]。因此要保證中藥藥效，應增加以有效性為目的的質量控制方法，以達到中藥質量可控的目的[10-11]。而以直接測定藥物的有效性的生物活性測定法，體現了在中藥質量控制中的優勢，2010年版和2015年版《中國藥典》也已經增加了《中藥生物活性測定指導原則》，充分體現了生物活性測定已經成為了中藥質量控制中的作用[11-14]。芮菁等[15]以30 mL/kg的劑量采用小鼠體內血栓形成、大鼠血小板聚集、小鼠急性腦缺血試驗建立了燈盞細辛注射液生物活性的測定方法，潘善慶等[16]以10 mL/kg的劑量采用CCl4肝損傷小鼠建立了立肝炎靈注射液生物活性的測定方法。

鹽酸異丙腎上腺素注射液是兒茶酚胺類物質，為β受體激動劑，使心肌耗氧量明顯；而其誘導的心肌缺氧模型由于其易于操作、穩定可靠，在心血管疾病研究中為經典的實驗。因此，本試驗采用該經典方法以復制小鼠心肌缺氧缺血模型[8]。

在實驗中，選擇具有活血化瘀功能的川芎嗪作為陽性藥，實驗結果顯示，與模型組比較，心腦寧膠囊以0.68 g/kg、1.35 g/kg劑量給藥3 d后，可顯著增加缺氧小鼠的存活時間（P<0.05） ，分別增加21.42%、25.31%。并根據《中藥生物活性測定指導原則》進行了方法學驗證，且12批樣品均具有較好的生物活性，使小鼠存活時間增加24.74%以上（P<0.05），結果表明該法操作簡單靈敏度高、重復性好，可用于心腦寧膠囊質量控制的生物活性測定。

隨著研究的深入，如今已應用生物活性測定來評價中藥的質量，如采用部分凝血酶時間法測定水蛭的抗凝活性[17]、抑菌圈檢測法測定扶正消積膠囊的抗菌效價[18]、管碟法測定雙黃連口服液的抗菌效價[19]。生物活性測定法作為對現有質量標準的一個補充完善，將會有更多的研究報道以使其得到更好的推廣應用。

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（收稿日期：2017-09-14）endprint