ZAG對結腸腺癌癌癥惡病質小鼠脂質代謝的影響

張培趁，石玲燕，周鋒，武文一，余震，3

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 胃腸外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 消化內科，浙江 溫州 325015；3.上海市第十人民醫院 普通外科，上海 200072）

癌癥惡病質（cancer cachexia，CC）是腫瘤患者常見的一種糖脂代謝綜合征[1-2]。鋅-α2-糖蛋白（zinc-alpha2-glycoprotein，ZAG）是一種新型脂質動員因子，廣泛分布于肝臟、腎臟、心肌、前列腺和乳腺[3-4]。在脂肪組織中，ZAG與脂聯素水平呈正相關，與瘦素水平呈負相關，后兩者均為重要的脂肪細胞因子[5]。本研究通過構建小鼠結腸腺癌CC模型，探究腫瘤組織、脂肪組織和血清中ZAG的表達水平與體質量減輕、脂聯素表達水平的相關性，進一步了解ZAG在CC中調控脂肪代謝的潛在機制。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠結腸腺癌細胞株colon-26購自美國菌種保藏中心；雄性BALB/c小鼠，8周齡，體質量18～20 g，SPF級，購于中國醫學科學院實驗動物研究所[動物使用許可證號：SYXK（浙）2015-0009]；ZAG雙抗體夾心酶聯免疫試驗（ELISA）檢測試劑盒購自美國BioVendor公司；脂聯素檢測試劑盒購自美國R&D公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；β-actin一抗購自北京博奧森生物工程有限公司；ZAG一抗購自美國Santa Cruz公司；RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 分組：健康雄性BALB/c小鼠隨機分為2組，即健康對照組（HC組）和造模組。造模組構建小鼠結腸腺癌動物模型，HC組不做處理。各組小鼠均自由攝食飲水。稱重并記錄各組小鼠體質量。

1.2.2 動物模型的制備：參照文獻[6]的方法，對造模組小鼠進行術前麻醉（異氟醚吸入麻醉），仰臥位固定小鼠，右側腋窩乙醇消毒后，用一次性無菌注射器皮下注射0.2 mL細胞濃度為1×106/mL的colon-26單細胞懸液，約7 d后，肉眼可見有腫瘤結節生成，則小鼠結腸腺癌動物模型構建成功。每日觀察小鼠一般情況（體質量、攝食量、活動狀態等），并做記錄。當造模組小鼠與HC組小鼠對比，出現攝食量減少、體質量明顯減輕、精神萎靡、毛色暗雜、行動遲緩等惡病質特征時，即結腸腺癌CC動物模型構建成功[7-8]。選取出現CC癥狀的小鼠為結腸腺癌惡病質組（CC組）、未出現CC癥狀的造模組小鼠為腫瘤組（TC組）、HC組各6只進行后續研究。

1.2.3 樣本采集：建模后第12天，3組小鼠稱取體質量后心臟采血，4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，取上清，備用。處死小鼠，剝離TC組和CC組的腫瘤組織以及TC組的癌旁組織，并測量每組腫瘤組織的體積。另取3組小鼠腹壁皮下脂肪組織。

1.2.4 qRT-PCR檢測ZAG和脂聯素的mRNA表達水平：利用Trizol試劑提取腫瘤組織、脂肪組織和血清中總RNA，逆轉錄合成cDNA，并進行qRT-PCR，ZAG和脂聯素mRNA的表達量以β-actin表達量為內參照，按照2-Ct法計算。

1.2.5 Western blot檢測ZAG蛋白表達：取500 mg小鼠腫瘤組織用眼科剪剪成小塊，置于離心管中，加入含1% PMSF的蛋白裂解液2 mL，用勻漿器每次30 s低速勻漿，每次勻漿間隔冰浴1 min，至組織完全裂解，將離心管移至離心機，于4 ℃、14 000 r/min離心15 min，離心后的上層清亮液分裝至新的離心管中備用。BCA法定量總蛋白后，取等量樣本進行10% SDS-PAGE電泳；將凝膠上的蛋白轉膜至PVDF膜；室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h。再用1%脫脂奶粉稀釋一抗，孵育1 h，4 ℃過夜。最后在室溫下孵育辣根過氧化物酶標記的二抗，得到的蛋白條帶通過ECL化學發光液顯影，拍照。

1.2.6 ELISA檢測ZAG蛋白濃度：將脂肪組織置于含蔗糖、Tris-HCl緩沖液、EDTA以及蛋白酶抑制劑的混合物中勻漿，并離心，棄去脂肪層，利用BCA法定量總蛋白后，用ELISA檢測脂肪組織ZAG的蛋白濃度。

1.2.7 外源性ZAG對CC小鼠體質量的影響：pcDNA 3.l（-）-h ZAG質粒經Eco RV/Hindll III雙酶切后，插入mZAG表達序列連接而成，經轉染鑒定，可表達鼠源ZAG蛋白。腺病毒骨架質粒亦經Eco RV/Hindll III雙酶切后，回收Vector DNA，通過Lipofectamine共轉染至脂肪細胞內，經PCR鑒定后，進行擴增，純化，制成重組腺病毒（pcDNA-ZAG）。構建小鼠結腸腺癌CC模型（造模方法同上），選取相同條件下喂養，體質量相近的小鼠12只，隨機分為2組，每組6只，分別向小鼠右腋皮下注射重組腺病毒（pcDNA-ZAG組）和空載體（pcDNA組），在相同條件下飼喂12 d后，觀察并記錄每組小鼠體質量變化，繪制體質量變化曲線，并收集相應的腫瘤組織，繪制2組小鼠腫瘤體積變化曲線，并檢測ZAG的蛋白表達水平。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS15.0軟件進行統計。計量資料采用±s表示，若數據呈正態分布且方差齊性，組間比較用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析；并運用Spearmen相關性分析TC組和CC組脂肪組織ZAG mRNA表達水平與體質量減輕值的相關性以及血清ZAG和脂聯素mRNA表達水平的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

圖1 小鼠一般狀況

圖2 腫瘤組織中ZAG mRNA（A）和蛋白（B）表達水平

2.1 腫瘤組織中ZAG mRNA和蛋白表達水平 CC組建模成功后，小鼠出現明顯食欲不振，體質量減輕，見圖1；通過qRT-PCR檢測腫瘤組織中ZAG mRNA的表達水平，結果表明與癌旁組織相比，TC組和CC組腫瘤組織中ZAG mRNA表達水平顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），CC組ZAG mRNA表達水平顯著高于TC組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2A；Western blot檢測結果也表明，ZAG蛋白表達水平在癌旁組織、TC組腫瘤組織和CC組腫瘤組織中呈現逐漸升高趨勢（P＜0.05），見圖2B。

2.2 脂肪組織中ZAG蛋白濃度和mRNA表達水平 通過ELISA分別檢測HC組、TC組、CC組的脂肪組織中ZAG蛋白濃度，結果表明，TC組與HC組比ZAG蛋白表達水平顯著升高，CC組與TC組和HC組比ZAG蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖3A；qRT-PCR檢測結果也表明3組脂肪組織中ZAG mRNA表達水平變化與蛋白相同（P＜0.05），見圖3B。TC組和CC組的ZAG mRNA與體質量減輕值的相關性分析結果表明：ZAG mRNA與體質量減輕值之間呈正相關（r=0.96，P＜0.001），見圖4。

圖3 脂肪組織中ZAG蛋白（A）和mRNA（B）表達水平

圖4 脂肪組織ZAG mRNA與體質量減輕值的相關性（n=12）

2.3 血清中ZAG和脂聯素mRNA表達水平 通過qRTPCR檢測TC組和CC組小鼠血清中ZAG和脂聯素的mRNA表達水平，結果表明，TC組和CC組血清中ZAG脂聯素mRNA表達水平與HC組比升高，CC組與TC組比，血清中ZAG脂聯素mRNA表達水平也有升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖5；相關分析結果表明：TC組和CC組小鼠血清中ZAG和脂聯素的mRNA表達水平呈正相關（r=0.93，P＜0.001），見圖6。

2.4 外源性ZAG對CC小鼠的體質量影響 與pcDNA組比，pcDNA-ZAG組小鼠體質量明顯減輕，2組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖7A-B；但腫瘤體積2組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖7C。

3 討論

CC常以脂肪代謝紊亂為主要特征，包括脂肪分解加快和合成減少，其發生機制既與腫瘤本身相關，又與脂肪細胞因子的調控有關。近年來，隨著CC致殘率和致死率逐年升高，對其引起的脂代謝異常的研究也受到越來越多的關注。ZAG是一種新型脂肪細胞因子，它一方面通過激活細胞膜上β3腎上腺素受體，介導胞內cAMP信號通路，最后活化激素敏感性脂酶（hormone sensitive lipase，HSL），促進脂肪分解[9]；另一方面，通過提高非酯化脂肪酸（nesterified fatty acid，NEFA）、三酰甘油以及解偶聯蛋白（uncoupling protein，UCP）的表達，促進脂肪氧化利用[10]。此外，ZAG還可通過抑制前體脂肪細胞分化，抑制脂肪細胞形成[11]。最近研究表明，ZAG能通過調控其他脂肪細胞因子如脂聯素、瘦素、TNF-α、IL-6等的表達，調節脂肪代謝[12-14]。

本研究通過給小鼠接種colon-26結腸腺癌細胞株構建小鼠結腸腺癌動物模型和結腸腺癌CC動物模型，并在此基礎上分離腫瘤組織，觀察CC對ZAG mRNA和蛋白表達水平變化的影響。結果表明，CC小鼠腫瘤組織中的ZAG mRNA和蛋白表達水平均顯著高于非惡病質荷瘤小鼠。相似的研究也在小鼠皮下脂肪組織中展開，結果發現：在ZAG mRNA表達水平和蛋白濃度方面，CC小鼠比非惡病質荷瘤小鼠顯著增高；同時還發現，ZAG mRNA表達水平與小鼠體質量減輕呈正相關。上述的研究結果與BING等[15]的研究成果一致，均表明ZAG在CC體內的表達增加與體質量減輕密切相關。

圖5 血清中ZAG（A）和脂聯素（B）mRNA表達水平

圖6 血清中ZAG和脂聯素mRNA表達水平的相關性（n=12）

圖7 外源性ZAG對CC小鼠的體質量（A、B）和腫瘤體積（C）的影響

脂聯素作為脂肪細胞分泌的主要細胞因子之一，可有效降低體循環中游離脂肪酸和總膽固醇量，在脂肪代謝方面起著重要作用。WELTERS等[14]的研究也證實，敗血癥患者血清中脂聯素水平與ZAG含量呈正相關。為此，本研究進一步探究了結腸腺癌CC小鼠ZAG mRNA表達水平的升高與脂聯素表達的相關性，檢測3組小鼠血清中ZAG和脂聯素的mRNA表達水平，結果顯示，CC小鼠的ZAG和脂聯素的mRNA表達水平均顯著高于非惡病質荷瘤小鼠，并且兩者的mRNA表達水平呈正相關。

為了進一步驗證外源性ZAG是否和腫瘤組織、脂肪組織內源性分泌的ZAG一樣均能顯著降低小鼠體質量，本研究通過構建小鼠結腸腺癌CC模型后，在體注射ZAG質粒，并對比注射前后的體質量及腫瘤體積變化。結果顯示注射pcDNA-ZAG后未對腫瘤的生長造成顯著影響，但小鼠體質量顯著降低，表明外源性ZAG和內源性ZAG一樣都有減輕小鼠體質量的作用。這一結果與RESSELL等[16]的研究結果一致。

綜上所述，結腸腺癌CC導致小鼠體內分泌的ZAG顯著增加，且ZAG表達水平增加與小鼠體質量降低以及血清脂聯素表達水平升高存在密切聯系，這也預示著ZAG在CC患者脂肪代謝中可能發揮重要的調控作用。

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