長鏈非編碼RNA CasC7對宮頸癌細胞增殖的影響

嚴德文，胡盈盈，梁宗文，項軍淼，余丹揚，段萍

（1.臺州市第一人民醫院 婦科，浙江 臺州 318020；2.溫州醫科大學附屬第二醫院 婦產科，浙江溫州 325027）

宮頸癌是第三大最常見的婦科腫瘤，同時也是全世界婦女癌癥相關死亡的第四大原因；全球的宮頸癌發病率每年約為530 000例，每年近275 000人死亡；且發病年齡愈加趨于年輕化。可是，對于宮頸癌發生發展中涉及的分子機制仍然知之甚少。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）被定義為長度大于200個核苷酸，具有基因表達調節功能但不編碼產生蛋白質的非編碼RNA轉錄本[1-2]。lncRNA能通過參與表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控這三個層面影響細胞的胚胎發育、干細胞分化、蛋白質編碼基因調控、細胞增殖凋亡、腫瘤細胞的放化療耐性等生理病理過程[2-3]。而且越來越多的研究證實lncRNA涉及到眾多不同類型的腫瘤，如肝癌、胃癌、骨肉瘤、結直腸癌、乳腺癌等的增殖、轉移侵襲等生物學過程[4-8]。其中，CasC7是RISC催化組件（AGO2）基因中一條9 346 bp的lncRNA，其在腫瘤中的相關研究尚未見報道。本研究旨在探究lncRNA CasC7在宮頸癌中的表達及其促增殖作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株：人宮頸癌細胞系HeLa細胞（HPV18陽性）、SiHa細胞（HPV16陽性）、CaSki細胞（HPV16陽性）及H8細胞（正常宮頸上皮細胞）均購自中國細胞庫典藏細胞中心。

1.1.2 標本：選取2014年6月至2016年6月于臺州市第一人民醫院進行手術的患者，其中40例宮頸癌組織收集自未經過放療或化療的廣泛性子宮切除手術的宮頸癌患者，＞ IIa的標本取自放化療前行陰道鏡檢查的患者。40例宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）組織取自行宮頸環形電切術的患者并且根據組織病理學診斷分為CIN I 14例，CIN II 13例，CIN III 13例。40例宮頸正常組織取自經子宮全切手術的子宮肌瘤或子宮腺肌瘤患者，且均經病理確認為無腫瘤組織且人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）及薄層液基細胞學檢測（thin-cytologic test，TCT）均為陰性。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者均已簽署知情同意書。

1.1.3 主要試劑：胎牛血清、RPMI1640培養基、DMEM高糖培養基購自美國Gibco公司；總RNA提取試劑TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit購自日本TOYOBO公司；SYBR實時熒光定量試劑購自美國羅氏公司；CCK-8試劑購自日本同仁株式會社；其余試劑為分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學：使用生物信息學方法挖掘公共芯片數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）（http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）中的RNA表達的相關數據。從GSE9750表達譜芯片中提取到9例宮頸癌細胞系，33例宮頸癌組織以及24例宮頸組織的lncRNA CasC7相關表達數據。

1.2.2 總RNA提取和cDNA合成：①細胞RNA提取：將細胞密度達80%～100%的宮頸癌細胞用PBS清洗3次后，TRIrol試劑裂解細胞，異丙醇沉淀總RNA，75%乙醇洗滌RNA后用DEPC水溶解RNA。用紫外分光光度計測定總RNA濃度。②組織RNA提取：切取一小塊-80 ℃保存的宮頸癌樣本組織，研磨震蕩后，用TRIzol溶解總RNA，異丙醇沉淀總RNA，75%乙醇洗滌RNA后用DEPC水溶解RNA。在紫外分光光度計測定總RNA濃度。③cDNA合成：取1 μg的總RNA為模板，以Oligo（dT）引物和隨機引物反轉錄合成cDNA第一鏈。反應條件：16 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，4 ℃永久。

1.2.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：取上述反轉錄后的cDNA 1 μL，加入10 μL 2×SYBR Green Premix配制成20 μL的反應體系。置于Step One PlusTMqRT-PCR系統，反應條件：95 ℃ 5 min預變性，95 ℃ 15 s、60 ℃ 32 s、72 ℃ 32 s循環40次。每個樣本設置3個復孔，且以GAPDH作為內參，以2-△△CT方法計算目的基因的相對表達水平。CasC7上游引物為5’-TGTTTGATTCCTCGTCGCT-3’，下游引物為5’-GGCACCGTAATGGCACTG-3’；GAPDH上游引物為5’-CTGCCAACGTGTCAGTGGTG-3’，下游引物為5’-TC AGTGTAGCCCAGGATGCC-3’。

1.2.4 細胞轉染：用Lipofectamine 2000轉染試劑進行轉染，具體操作步驟如下（以96孔板轉染為例）：轉染前1 d對細胞進行傳代，每孔接種約5 000個細胞。過夜后在無菌EP管中加入25 μL Opti-MEM轉染試劑，分別加入0.25 μL的siRNA或者0.25 μL的Lipofectamine 2000，輕柔混合后，室溫靜置5 min；將含有Lipofectamine 2000的Opti-MEM試劑加入到含siRNA的Opti-MEM轉染試劑中，混合后室溫靜置15～25 min，以形成siRNA/lipo-fectamine復合物；取siRNA/lipofectamine復合物50 μL加入到含有細胞和培養基的培養板的孔中，來回輕柔晃動細胞培養板。細胞在CO2培養箱中37 ℃孵育4～6 h后，除去復合物，更換培養基，以防止細胞死亡，繼續培養至實驗用。

1.2.5 CCK-8實驗：采用CCK-8實驗檢測下調lncRNA CasC7的表達對宮頸癌細胞增殖的影響。對SiHa、CaSki、HeLa和H8細胞經細胞計數后，分別將細胞接種至96孔板中，過夜后分別進行si-CasC7、si-NC的轉染。轉染完成后根據不同時相點（0、24、48、72 h）進行CCK-8檢測。每孔加入10 μL CCK-8溶液，再置于細胞培養箱中孵育約1 h后置于酶標儀進行檢測。

1.3 統計學處理方法 所有數據均采用SPSS17.0軟件進行統計分析。正態分布計量資料用±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；非正態分布計量資料用M（P25，P75）表示，2組間比較用Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CasC7在表達譜芯片中的表達情況 通過GEO數據庫中發布的芯片數據查找lncRNA CasC7的表達情況，結果顯示，GSE9750表達譜芯片中9種宮頸癌細胞系和33例宮頸癌組織的lncRNA CasC7表達量均較正常宮頸組織升高（P＜0.01），見圖1。

圖1 CasC7在宮頸癌表達譜芯片GSE9750中的表達情況

2.2 CasC7在宮頸癌組織及細胞中的表達 qRTPCR結果顯示，宮頸癌組織中的lncRNA CasC7表達水平明顯高于CIN組織（P＜0.01）及宮頸正常組織（P＜0.001），CIN組織中CasC7的表達水平高于宮頸正常組織（P＜0.01），見圖2A。以正常宮頸上皮細胞（H8細胞）為參照，在3種宮頸癌細胞系中CasC7均顯著高表達（P＜0.05），見圖2B。

2.3 CasC7表達情況與宮頸癌的臨床病理特征的關系 為了分析宮頸癌中lncRNA CasC7的表達水平和患者臨床病理之間的關系，將40例宮頸癌患者根據其臨床特征及病理嚴重程度分為2組，比較2組間CasC7表達水平的差異。CasC7表達水平越高，其相應的宮頸癌腫瘤組織標本的FIGO分期越高（P=0.001），分化越差（P=0.015），但與其他臨床病理特征如年齡、腫瘤大小、組織學分型、淋巴結轉移陽性率、血清鱗狀細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag）的水平差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。

圖2 qRT-PCR檢測CasC7在宮頸癌中的相對表達量

2.4 CasC7對宮頸癌細胞增殖的影響 CCK-8法觀察下調lncRNA CasC7對宮頸癌細胞增殖的影響，實驗結果表明，與轉染si-NC的對照組比，轉染了siRNA CasC7的3種宮頸癌細胞（SiHa、CaSki、HeLa）的細胞增殖能力均有所下降（P＜0.05）。并且，siRNA CasC7對宮頸癌細胞系生長的抑制效應呈時間依賴性（見圖3）。

3 討論

人類基因組中，能編碼蛋白質的基因有2～2.5萬個，只占整個基因組的不到2%，大部分基因轉錄為非編碼RNA（noncoding RNAs，ncRNAs）[4-5]。這些序列過去被認為是基因組中的“噪音”或者“暗物質”。隨著基因測序技術的發展，越來越多的證據表明這些“噪音”能發揮重要的生物學功能，這些基因序列絕大多數能以組織特異性或時空特異性的方式轉錄成RNA，其中包括lncRNA[6-7]。lncRNA是一類轉錄本長度超過200個堿基的ncRNA，且無或很少有編碼蛋白的能力[9]。研究發現，lncRNA的表達或功能異常與癌癥、退行性神經疾病等人類疾病的發生密切相關[10-14]。其中，lncRNA就被報道與宮頸癌的發生發展有關；如lncRNA MEG3在宮頸癌中下調表達并通過調節miR-21而影響宮頸癌細胞的增殖和凋亡[15]；下調宮頸癌中MALAT1的表達能通過影響上皮間質轉化過程從而抑制宮頸癌細胞的遷移和侵襲[16]；lncRNA HOTAIR通過調節mTOR通路從而促進宮頸癌細胞的增殖和侵襲[17]。同時研究表明lncRNA與宮頸癌的臨床病理學特征密切相關：如lncRNA-TCONS_00026907過表達的宮頸癌患者，其腫瘤更大，TNM分期更晚，淋巴結轉移更多[18]。而過表達lncRNA-ANRIL與宮頸癌患者的FIGO分期及淋巴結轉移情況密切相關，同時是宮頸癌患者預后不良的獨立危險因素[19]。此外，lncRNA-HOXA11-AS過表達會促進宮頸癌的脈管侵犯及淋巴結轉移，同時影響患者預后[20]。

表1 CasC7表達水平和宮頸癌患者臨床病理特征的關系[n=40，M（P25，P75）]

圖3 轉染si-CasC7抑制宮頸癌細胞增殖

本研究率先報道lncRNA CasC7在宮頸癌中的作用。我們首先通過提取GSE9750表達譜芯片中RNA CasC7相關的表達數據，結果顯示相較于24例正常的宮頸組織，lncRNA CasC7在33例宮頸癌組織以及9種宮頸癌細胞中均明顯高表達。芯片的9種宮頸癌細胞系包含C4-I、CaSki、C-33A、HT-3、SiHa、SW756、MS751、ME-180、HeLa細胞系，我們通過qRT-PCR實驗進一步驗證了lncRNA CasC7在SiHa、CaSki、HeLa這3種常見宮頸癌細胞系以及宮頸癌組織標本中表達水平和芯片的表達情況一致。同時，我們分析lncRNA CasC7的表達水平和臨床病理特征之間的關系，發現CasC7的高表達與更高的FIGO分期，更差的分化有關。LENNOX等[21]證實了lncRNA CasC7既存在于胞核中也存在于胞漿中，因此我們通過siRNA瞬時抑制CasC7表達的方法，證實下調CasC7的表達能抑制宮頸癌細胞的增殖，進一步從細胞學行為闡述了CasC7在宮頸癌中的促癌基因作用。

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