神經肌肉電刺激對低O2高CO2大鼠下肢骨骼肌miR-1相關通路的影響

潘錄錄，支英豪，王小同

（1.溫州市中醫院 康復科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫科大學附屬第二醫院 康復科，浙江 溫州325027）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一組氣流受限為特征，氣流受限不完全可逆，呈進行性發展，但可預防和治療的疾病。許多研究均表明COPD患者存在不同程度的骨骼肌功能障礙，主要體現在運動耐量的下降[1-2]。其中COPD患者下肢骨骼肌具有特征性改變：能量代謝形式轉變，線粒體密度降低，活性氧自由基產生增多等，這些改變可以歸咎為慢肌纖維的減少（I型肌纖維向 II型轉變），最終導致肌耐力下降[3]。然而COPD骨骼肌功能障礙的確切病理生理機制仍不明確[4]。

本課題組前期以慢性間歇性低O2高CO2（chronic intermittent hypoxia hypercapnia，CIHH）動物模型成功模擬了COPD的主要病理生理過程[5]，發現大鼠暴露在CIHH環境僅超過2周即可造成骨骼肌障礙，肌纖維出現局部萎縮，并且排列紊亂，脂肪沉積增多，炎性細胞浸潤，肌細胞線粒體結構破壞明顯[6-7]。證實了COPD模型大鼠存在骨骼肌功能障礙。研究表明miR-1與骨骼肌障礙關系密切，miR-1可通過調節骨骼肌相關的蛋白調節骨骼肌基因表達，進而影響肌細胞的增生和分化過程[8]。組蛋白脫乙酰基酶4（histone deacetylase 4，HDAC4)、肌細胞促進因子2（myocyte enhancer factor 2，MEF-2）和過氧化體增殖物激活型受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferators ac-tivated receptor coactivator 1α，PGC-1α）均是miR-1可能影響的下游蛋白分子，因此通過測定miR-1及相關信號通路可進一步明確骨骼肌障礙情況，探索其在骨骼肌中的作用。本研究通過測定miR-1及相關信號通路的蛋白變化，探討COPD大鼠模型骨骼肌功能障礙的可能機制，同時通過應用神經肌肉電刺激（neuromuscular electrical stimu-lation，NMES）進一步研究康復訓練對COPD骨骼肌功能障礙的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組：成年SPF級雄性SD大鼠24只（由溫州醫科大學動物實驗中心提供，動物使用許可證號：wydw2014-0006）。初始體質量為160～180 g。將大鼠編號后按照隨機數字表法分成對照組（NC組）、造模組（HH組）和電刺激組（HE組），每組8只。

1.1.2 儀器：動物實驗復合模擬艙（濰坊華信氧業有限公司），電刺激儀（HANS-200E，濟南濟生生物醫療儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 低O2高CO2模型建立[7]：將HH組和HE組大鼠放入氧艙內飼養，飼料及水充足，選用低O2高CO2模式，維持艙內O2濃度為9.0%～11.0%，CO2濃度為5.0%～6.0%，每天8 h，每周7 d，一共4周，造模時NC組大鼠置于對照艙內。每天造模完成后3組大鼠放置在同一房間內（室溫22 ℃左右，相對濕度45%～65%），各組均可自由獲取水和食物。

1.2.2 NMES方法：將所有大鼠固定好，雙側小腿腓腸肌肌腹部局部去毛，放置表面電極片（1.5 cm×1.5 cm）使之完全覆蓋肌肉，只有HE組大鼠應用電刺激儀器進行刺激。參數：100 Hz和2 Hz交替進行的電刺激（持續時間均為3 s，脈沖持續時間：0.3～1.0 ms，根據頻率改變而改變）；強度以中等程度的肌肉收縮為準（2～5 mA）。

1.2.3 耐力跑步能力測定：參照文獻[9]，造模完成后進行動物耐力跑步能力測定。第一階段（2 d）：逐漸增加大鼠跑步的時間使大鼠適應跑臺（ZH-PT，淮北正華生物儀器設備有限公司）。使大鼠能在速度為10 m/min，傾斜度為15°的跑臺上跑步。接下來，緩慢地增加速度至15 m/min，當大鼠因停止跑步從皮帶上滑落到15 cm×15 cm的電擊網上時，會受到頻率3 Hz，電流1.2 mA的電擊，重復這個過程直到大鼠學會在跑臺上持續奔跑5 min。第二階段（2 d）：測定大鼠的耐力跑步能力。起始速度10 m/min，15°坡度，以每2 min 1 m/min的速度加速，直到因大鼠竭力而終止實驗，記錄下跑步距離代表耐力跑步能力。竭力的標準：大鼠因疲勞第3次滑落到電極網上并持續2 s不愿跑步。

1.2.4 骨骼肌分離提取：配置10%的水合氯醛，稱量每只大鼠的體質量后，按照0.4 mL/100 g的劑量，經腹腔注射麻醉藥，待大鼠進入麻醉狀態后，迅速分離腓腸肌，分離后的組織一部分迅速放入配置好的4%多聚甲醛固定液中固定24 h，后經梯度蔗糖脫水后用OCT包埋。另一部分組織不經處理迅速放入-80 ℃冰箱保存。大鼠最后經過量的水合氯醛注射處死，實驗過程符合實驗動物倫理學標準。

1.2.5 免疫組織化學染色：選取10 μm的冰凍切片，置高壓鍋煮沸的枸櫞酸鹽（pH=6.0）修復液中，約5 min，后常溫放置20～30 min使切片溫度降低。放入PBS中洗3次，每次5 min，用10%山羊血清封閉30 min，甩凈切片上的山羊血清后滴加MHC-I抗體（上海碧云天生物技術有限公司），濃度為1∶4 000，4 ℃孵育過夜；第2天用PBS清洗切片3次，每次5 min，根據二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）的操作步驟，先用10%過氧化氫封閉內源性過氧化氫酶10 min，經PBS清洗后用聚合物輔助劑孵育20 min，再次用PBS清洗后孵育二抗30 min，用DAB顯色液顯色，最后用Olympus顯微鏡觀察并攝取相應圖片。

1.2.6 Western blot：取100 mg的腓腸肌充分剪碎，置于1 mL研磨管中，加入含1 mmol/L PMSF和1 mmol/L組織裂解液（RIPA）60～100 μL/20 mg，RIPA∶PMSF=99∶1，置于高速震蕩儀上，震蕩3～4次，每次40 s，間隔5 min。將研磨管置于勻漿器上勻漿，放置于冰上靜置20 min，12 000 r/min，離心15 min。取上清，分裝，-80 ℃保存。備一管用來測定蛋白濃度。用細胞核蛋白抽提試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）獲取核蛋白以備核內HDAC4測定。蛋白上樣體系配置：先用BCA試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）測定蛋白濃度，加雙蒸水及Loadingbuffer配置成上樣體系。配置好后經100 ℃ 5 min將體系變性，放入-20 ℃冰箱保存。電泳時選用8%分離膠進行蛋白分離，后濕轉至PVDF膜。轉膜結束后，5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗后，放入經稀釋的PGC-1α（美國Calbiochem公司）、HDAC4（美國Cell Signaling公司）和MEF-2（美國Santa Cruz公司）一抗中4 ℃孵育過夜，抗體稀釋濃度分別為1∶1 000，1∶1 000，1∶200；二抗分別選用山羊抗鼠和山羊抗兔（美國Biosharp公司）室溫孵育2 h，二抗濃度1∶2 000；內參Tubulin（上海碧云天生物技術有限公司），稀釋倍數為1∶2 000。

1.2.7 qRT-PCR：取100 mg組織研磨后加1 mL Trizol（美國Invitrogen公司）抽提試劑加入200 μL

1.3 統計學處理方法 采用SPSS16.0統計軟件進行分析。計量資料采用±s表示，首先對數據進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD（方差齊）或Dunnett’T3（方差不齊）方法進行分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠跑步距離及慢肌纖維比例的比較 NC組與HH組大鼠跑步距離差異無統計學意義（P=0.054）；與HH組比，HE組大鼠的跑步距離明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；HH組的慢肌纖維比例較NC組明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；HE組較HH組慢肌纖維比例明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1和圖1。氯仿/異戊醇（24∶1），振蕩混勻30 s，放置5 min；高速冷凍離心機離心10 min（12 000 r/min，4 ℃）；抽取上清液轉移到去酶的1.5 mL離心管內，加入與上清液等體積的異丙醇和1.0 μL的糖原，室溫下放置5 min；再次高速冷凍離心機離心8 min（12 000 r/min，4 ℃）；移去上清液，用70%乙醇洗滌2次，每次700 μL，再分別離心2 min和5 min（12 000 r/min，4 ℃）；待乙醇揮發完全后，用20 μL DEPCH2O溶解RNA。檢測總RNA濃度后嚴格按照試劑盒中的要求進行miRNA反轉錄和qPCR反應液的配制，反應條件：預變性：95 ℃，10 min，1個循環；PCR反應：95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，40個循環；延伸：72 ℃ 1 s，7 min，1個循環；冷卻：40 ℃30 s，1個循環。

表1 3組大鼠跑步距離和慢肌纖維比例比較（n=8，±s）

表1 3組大鼠跑步距離和慢肌纖維比例比較（n=8，±s）

與NC組比：aP＜0.05；與HH組比：bP＜0.05

NC組 532.0±47.4 88.5±4.1 HH組 406.0±40.2 71.6±2.9a HE組 539.0±44.9b 80.5±3.3b

2.2 腓腸肌中的miR-1表達 HH組miR-1表達較NC組明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05），HE組miR-1表達較HH組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），HE組miR-1表達較對照組同樣增高明顯，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 腓腸肌中miR-1相關蛋白表達 HH組PGC-1α、MEF-2、核內HDAC4蛋白表達均較NC組明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05），HE組核內HDAC4、PGC-1α和MEF-2蛋白表達較HH組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），且HE組MEF-2蛋白表達較NC組仍明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖1 慢肌纖維的免疫組織化學染色結果（×200，深色部分為慢肌纖維）

圖2 3組大鼠腓腸肌中miR-1表達（n=8）

圖3 3組腓腸肌中相關蛋白表達（n=8）

3 討論

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一種由真核生物的核DNA編碼的單鏈RNA分子（18～24個核苷酸），它不具有編碼功能，但可通過轉錄后調節機制影響基因表達。MyomiRs在心肌和（或）骨骼肌中高度表達，是一組可以調節骨骼肌生長發育和新陳代謝的特異性miRNAs[10]。近幾年來，關于miRNAs相關分子機制在COPD骨骼肌功能障礙的作用逐漸引起重視。研究發現COPD患者的股四頭肌肌力和步行時間較正常對照組明顯下降，同時COPD患者的股四頭肌存在明顯的肌纖維轉變（I型→ II型）和肌萎縮；該研究提出miR-1相關的IGF-1、SRF和HDAC4信號通路可能在COPD骨骼肌功能障礙中起到一定作用[11]。HDAC4是miR-1的一個主要靶蛋白，過表達的miR-1會下調HDAC4蛋白，從而起到調節骨骼肌分化的作用[8]。HDAC4能結合關鍵的肌轉錄因子MEF-2，HDAC4作為MEF-2依賴性的結構和收縮基因表達的關鍵調節劑，可影響MEF-2表達[12]。而MEF-2將調節PGC-1α：一種與MEF-2蛋白合作的活性轉錄因子，作為鈣調磷酸酶信號通路的一個靶蛋白[13]，它主要牽涉到慢肌纖維基因的表達[14]。因此通過測定HDAC4可一定程度地反映肌纖維轉變的情況。一項研究曾報道，穩定表達核內HDAC4的C2C12細胞會分化成大的肌管，具有更強的收縮力，這種收縮經常會導致其從培養皿上脫落，而這部分分離的肌管會形成球狀結構，說明核內HDAC4聚集對骨骼肌的分化有益[15]。

本研究發現，HH組大鼠的腓腸肌中核內HDAC4蛋白含量下降，miR-1在骨骼肌成肌細胞中起著抑制HDAC4表達的作用[16]，這解釋了HH組的miR-1含量越高而核內HDAC4含量越低的現象。相應地，HDAC4的重要靶蛋白MEF-2，在HH組表達明顯下降，進而影響它的下游蛋白PGC-1α的表現也出現明顯下降。與此同時，HH組大鼠的腓腸肌出現了慢肌纖維向快肌纖維的轉變，提示存在骨骼肌分化。這符合HH組觀察到的大鼠運動耐力較對照組稍下降的現象。關于HH組核內HDAC4減少的原因，筆者推測可能與HDAC4核外流或降解有關，有待進一步研究明確。對HH組大鼠施加NMES后可觀察到腓腸肌中miR-1的含量較HH組減少，相應地，HDAC4-MEF-2-PGC-1α通路的各蛋白表達均較HH組增多，同時HE組慢肌纖維比例較HH組明顯增多，即出現快肌纖維向慢肌纖維轉變，大鼠跑步距離也較HH組增加，說明NMES部分逆轉了因CIHH造成的大鼠骨骼肌病理改變，改善了大鼠耐力運動能力。綜上可以推測，核內HDAC4可能在調節肌肉分化中起到積極的作用，并且這種作用可能是通過影響MEF-2和PGC-1α蛋白發揮作用的。

運動訓練是目前緩解COPD骨骼肌功能障礙最有效的干預措施之一，其效果表現為一系列的生理性適應改變，如次極量運動時血乳酸水平降低，對心率和通氣功能的要求降低，形成有效的呼吸模式等，直接結局就是經過一定運動循環的COPD患者可逐步承受更高的活動量，維持更長時間的次極量活動[17]。然而，對于COPD患者而言，運動訓練最大的限制是患者在運動時可能會產生嚴重的呼吸困難，以致無法在訓練中達到要求的運動強度，而無法達到有效的治療。NMES是一種作用于局部骨骼肌的被動康復訓練方式，對呼吸系統的影響很小，在訓練時也不會對心臟產生過多的負荷[18]，大大降低了COPD患者康復訓練的門檻。本研究通過對COPD模型大鼠骨骼肌施加NMES治療，驗證了NMES可作為COPD骨骼肌功能障礙的有效康復措施，并且進一步揭示了NMES的治療作用可能是通過影響miR-1-HDAC4-MEF-2-PGC-1α信號通路而發揮的，為COPD患者的臨床康復治療提供了有利的理論基礎。

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