超高效液色譜相法檢測雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留

侯耀杰

（甘肅省獸藥飼料監察所，甘肅 蘭州 730030）

氟喹諾酮類藥物是一種廣譜抗生素，具有高效、低毒等特點，常用于動物飼料中，可促進動物生長，降低動物發病率[1]。因其在畜牧養殖業中廣泛應用，容易在動物性食品中造成藥物殘留，而長期食用具有抗生素殘留的動物性食品，容易引起許多問題，嚴重時會對人體中樞神經系統及心血管系統造成危害，甚至致癌[2-3]。

目前，雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留的檢測主要通過高效液相法、液質法等，液相法操作簡便有效，但傳統的常規液相法通常耗時較多，工作效率低，隨著超高效液相色譜在檢測工作中的廣泛應用，工作效率得到了極大的提高。本文中使用甲酸乙腈對樣品進行提取，經超高效液相法分析，對超高效液相法檢測雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留的結果進行匯總分析。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 超高效液相色譜儀Agilent 1290，電子天平PL402-L，電子天平AV412，高速冷凍離心機Bilguge stratos等。

1.2 試劑 乙腈（色譜純，Fisher），甲酸（Fisher）。

1.3 標準品 環丙沙星 （中國獸醫藥品監察所，99.8%），恩諾沙星 （中國獸醫藥品監察所，99.9%），沙拉沙星 （中國獸醫藥品監察所，99.6%），達氟沙星(QCC，99.6%）。

2 方法

2.1 色譜條件 流動相：0.1%甲酸溶液：乙腈（V/V）=82:18；柱溫：30℃；檢測波長：激發波長280nm,發射波長 450nm；流速：0.3ml/min；進樣體積：5μl； 色譜柱型號：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD色譜柱,1.8μm,2.1×150mm。

2.2 提取 取雞蛋，打碎去殼攪勻，稱取2.00g，置于50ml離心管中，加入8ml 1%甲酸乙腈溶液，渦旋混勻，振蕩 5min，10000r/min離心 5min，將上清液轉移入50ml離心管中。樣品殘渣中加8ml 1%甲酸乙腈溶液，重復提取一次，合并兩次提取液。提取液于40℃水浴中氮氣吹干，離心管中加4ml流動相，渦旋溶解，溶液轉入15ml離心管中，12000r/min離心5min，取上清液，過 0.2μm微孔濾膜，供超高效液相色譜檢測分析。

2.3 標準曲線繪制 稱取環丙沙星、恩諾沙星、達氟沙星、沙拉沙星標準品，用0.03mol/L氫氧化鈉溶液溶解配制成1mg/ml的儲備液，量取適當儲備液，以流動相稀釋成含有環丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星 1μg/ml和達氟沙星 0.2μg/ml的混合標準工作液。

適當量取混合標準工作液，用流動相分別稀釋成含有環丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星（5、25、50、100、500ng/ml) 和含有達氟沙星（1、5、10、20、100ng/ml）的系列標準工作液，上機測定后以標準液濃度為橫坐標，以標準液中各組分的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程和相關系數。

2.4 準確度和精密度 在空白雞蛋樣品中添加不同濃度的氟喹諾酮類標準溶液，做添加回收實驗，添加濃度為 10（達氟沙星 2μg/kg）、100（達氟沙星 20μg/kg）、200μg/kg （達氟沙星 40μg/kg），每個濃度做五個平行樣品，重復三次，計算回收率和批內、批間相對標準偏差。

3 結果與討論

3.1 氟喹諾酮類藥物殘留檢測，常規高效液相法使用250nm×4.6nm的C18色譜柱，流動相使用磷酸三乙胺-乙腈，但由于超高效液相的色譜柱短，粒徑細，且氟喹諾酮類藥物屬于兩性化合物，結構中同時含有羧基和可質子化的氮，因此在使用相同的流動相時，四種不同的藥物不能夠得到有效分離。后使用0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動相，四種藥物得到分離并且峰形良好。高效液相法檢測雞蛋中氟喹諾酮類藥物大約需要20min，而超高效液相在6.5min之內就能夠完成分析，很大程度上節省了時間，提高了工作效率。超高效液相法檢測雞蛋中氟喹諾酮類藥物的標準液圖譜和陽性添加圖譜見圖1、圖2。

圖1 氟喹諾酮類藥物的標準液圖譜

圖2 氟喹諾硐類藥物的陽性添加圖譜

3.2 實驗結果表明在1～500ng/ml范圍內，環丙沙星、恩諾沙星、達氟沙星和沙拉沙星各自的峰面積與濃度呈良好的線性關系，相關系數大于0.9999。標準曲線結果見圖3。

圖3 氟喹諾酮類藥物標準曲線

3.3 在實驗過程中，依照農業部781號公告-6-2006方法檢測雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留，四種氟喹諾酮類藥物的回收率不夠理想，使用1%的甲酸乙腈溶液提取，在空白試料中添加不同濃度的標準液，環丙沙星回收率范圍是76.5%～99.1%，恩諾沙星回收率范圍是73.4%～96.7%，達氟沙星回收率范圍是79.5%～97.4%，沙拉沙星回收率范圍是77.5%～98.9%，批內、批間RSD均小于10.0%，符合檢測要求。結果見表1。

表1 雞蛋中氟喹諾酮類藥物添加回收結果統計

4 結論

超高效液相法檢測雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留，較普通高效液相法檢測方法更為簡便快捷。以此方法檢測雞蛋中氟喹諾酮類藥物，前處理過程簡單，使用試劑較少，且超高效液相檢測靈敏度更高，分析時間較短，同時，結果穩定，重現性好，因此，該方法適用于雞蛋中氟喹諾酮類藥物的殘留檢測。

[1] 李丹,張玉潔,仲 鋒,等.雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量檢測方法研究[J].中國獸醫雜志,2010,44(6):1-4.

[2] 楊衛軍,李 曼,曹秀梅,等.超高效液相色譜法檢測雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留 [J].現代畜牧獸醫,2016,(4):8-12.

[3] 董艷峰,于靜泉,張 巍.超高效液相色譜法同時測定雞肝中五種氟喹諾酮類藥物殘留 [J].中國獸醫雜志,2010,44(6):5-8.