基于ISSR標記的油茶種質資源遺傳基礎分析

姜德志+方應有+肖賢

摘要：以油茶（Camellia oleifera Abel.）主產區的109個種質材料為試材，采用簡單序列重復區間分子標記（ISSR）和非加權組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚類分析，研究了這109個油茶種質材料遺傳相似系數及親緣關系分析，并構建了其進化樹關系。結果表明，①從49條ISSR引物中篩選出23條能夠擴增出清晰，穩定條帶的引物，23條引物共擴增出487條帶，其中多態性條帶有335條，多態性條帶比率為68.79%；②應用NTSYS2.10e軟件對擴增結果進行UPGMA法聚類分析，109個油茶種質材料的遺傳相似系數從0.61到0.93；③油茶種質資源豐富，遺傳相似系數在0.735時，可將109個油茶種質材料劃分為11個類群。類群I包括79個種質材料，該類群在相似系數為0.75處又可劃分為7個亞類群，且這些油茶種質材料間的親緣關系較近。但由聚類分析劃分的油茶類群來看，這些油茶材料的遺傳背景又比較復雜，具有豐富的遺傳多樣性。分析結果可為油茶主產區的品種資源開發、基因資源保存、后期品種審定及鑒別提供理論依據。

關鍵詞：油茶（Camellia oleifera Abel.）；種質資源；簡單序列重復區間標記；遺傳多樣性

中圖分類號：S794.4+95：Q943.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）02-0119-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.02.030

Abstract： 109 germplasm materials of Camellia oleifera Abel in the main producing areas were analyzed using inter simple sequence repeat markers（ISSR） and Unweighted pair-group method with arithmetic means （UPGMA） cluster analysis method to study the genetic correlation coefficient and genetic relationship， and constructe the phylogenetic relationship. The result showed that， （1） 23 primers with clear and stable bands were screened from 49 ISSR primers， and 487 bands were amplified by the 23 primers， of which 335 bands were polymorphic，and the polymorphic bands ratio was 68.79%.（2） NTSYS2.10e software was used to cluster the amplified results by UPGMA method； and the genetic similarity coefficients of 109 C. oleifera germplasm materials were from 0.61 to 0.93. （3） The germplasm resources of C. oleifera were rich. When the genetic similarity coefficient was 0.735， the 109 C. oleifera germplasm materials could be divided into 11 groups. The group I includes 79 germplasm materials， which can be divided into 7 sub groups at the similarity coefficient of 0.75， and the genetic relationship among these C. oleifera germplasm materials is closer. However， the genetic background of these C. oleifera germplasm materials is complex and rich in genetic diversity. The analysis results can provide theoretical basis for germplasm resources development， genetic resources conservation， late variety certification and identification in C. oleifera major producing areas.

Key words： Camellia oleifera Abel.； germplasm accessions； inter simple sequence repeat； genetic diversity

油茶（Camellia oleifera Abel.）為山茶科（Theacea）山茶屬（Camellia L.）植物[1]，是適應性強、分布廣泛的木本油料樹種，具有重要的經濟、社會和生態價值[2]。中國油茶種質資源極為豐富，各油茶產區都選育出了大量的優良單株、無性系和家系，全國共選出 200多個優良無性系[3]。但是由于遺傳背景與環境的影響，眾多無性系的形態特征出現了較大差異，導致油茶品種名稱混亂，同名異物、同物異名的現象時有發生[4]。因此，從分子水平上對油茶品種及新選育品系進行種群關系鑒別十分必要。現在分子標記技術發展快速，其在油茶研究中的應用也越來越廣泛[5]。簡單序列重復區間標記（Inter simple sequence repeat，ISSR）是類似隨機擴增多態性DNA標記（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）的一種聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）技術，是近幾年在微衛星分子標記基礎上發展起來的一種新型分子標記技術[6]。利用ISSR技術能夠檢測出較多的DNA多態性[7]。ISSR標記能有效揭示種群內的遺傳多樣性，進而分析其系統分化規律，研究群體遺傳結構及其多樣性程度[8]。ISSR技術極易受模板，引物以及Taq酶等因素的影響，任何一個因素的改變都可能使擴增產物發生變化[9]。因此需要對油茶ISSR分子標記的反應體系進行優化，才能使得到的結果更加精準。試驗選用ISSR技術探討國內的油茶種質資源遺傳相似性，以湖北省林業科學研究院油茶種質資源基地保存的油茶種質材料葉片為供試材料，旨在更快速、準確、簡便的鑒定這些材料間的親緣關系，從分子水平上為湖北省油茶種質資源的收集、鑒定和發展提供參考依據。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 植物材料為在全國油茶主產區采集的油茶種質材料，包括品種、優樹等，共109個樣品，各材料樣品編號見表1。每個樣品隨機選取10～20片幼嫩葉片，采摘后裝入做好標記的自封袋中，于-80 ℃冰箱中冷凍保存。

1.1.2 主要試劑 CTAB提取DNA試劑、30%聚丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、硝酸銀、氫氧化鈉、甲醛、無水乙醇、冰醋酸、親和硅烷、剝離硅烷等購自武漢宏博生物有限公司；瓊脂糖、5×TBE緩沖液、2×Taq PCR Master Mix購自北京天根生化科技有限公司；Maker DL2000購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 油茶基因組DNA的提取與檢測 參考楊翠芳等[10]和闕生全等[11]的CTAB法，略做改進，提取109個油茶種質材料葉片的總基因組DNA。于0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳，檢測所提基因組DNA的質量，用紫外分光光度計檢測DNA濃度，提取的總DNA保存于-20 ℃冰箱，備用，-4 ℃為短期存放條件。

1.2.2 引物來源及ISSR-PCR擴增反應體系的建立 試驗所用引物是依據油茶的EST文庫篩選出的ISSR序列，參照加拿大哥倫比亞大學網站公布的ISSR引物序列，共設計出49條擴增引物（SSR1～SSR49），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。ISSR-PCR擴增反應體系設為20 μL，包括2×Taq PCR Master Mix反應液（Tag Polymerase 0.1 U/μL、500 μmol dNTP each、20 mmol Tris-HCl、100 mmol KCl、3 mmol MgCl2及其他穩定劑和增強劑）10 μL、引物2 μL、DNA模板50 ng、ddH2O 6 μL。擴增程序設為94 ℃預變性3 min；然后94 ℃變性30 s，50～56 ℃退火40 s，72 ℃ 3 min，共35個循環；最后72 ℃延伸10 min[12]。

1.2.3 引物篩選 選用基因組DNA純度較高的油茶樣品為模板，分別對49個引物采用以上擴增程序進行PCR擴增。擴增產物先用1%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測，再用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進一步分析，篩選出的多態性較高的引物用于109個油茶樣品的鑒定[9]。

1.3 數據統計與分析

將選擴的PCR產物全部上樣6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，在30 V/cm電壓下電泳約90 min，經硝酸銀染色，氫氧化鈉顯影，所獲得的擴增條帶以0、1統計建立數據庫。同一引物擴增產物中電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性[13]。條帶統計以其清晰可重復為基本原則，采用人工讀帶法，在相同遷移位置上，有帶的記為1，無帶的記為0。在NTSYS 2.10e分析軟件中，根據SM相似系數法求得油茶種質材料間的遺傳相似性矩陣，再用非加權組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）進行聚類分析，構建系統聚類分析樹狀圖[14]。

2 結果與分析

2.1 引物篩選結果

試驗隨機選取油茶2個種質材料AH18和XL51的DNA為模板，分別對49條ISSR擴增引物進行篩選，淘汰無擴增產物和多態性差的引物，選留擴增條帶清晰且有明顯多態性片段的引物，結果見圖1、圖2。從圖1、圖2可見，在引物SSR8、SSR9、SSR13、SSR14、SSR15、SSR16、SSR17、SSR18、SSR20、SSR25、SSR30、SSR32、SSR36、 SSR38、 SSR43、 SSR45中均有多態性條帶，說明對應編號的引物都可為ISSR引物篩選提供參考。而對其他泳道沒有顯示多態性條帶的引物予以淘汰。結合聚丙烯酰胺電泳進一步分析，結果見圖2。從圖2可見，引物SSR7、SSR8、 SSR9、 SSR13、 SSR14、 SSR19、 SSR20、 SSR21、SSR28、SSR29、SSR32、SSR33、SSR34、SSR36的多態性條帶數清晰，再結合圖1初步篩選的結果，確定23條引物（表2）用于109個油茶種質材料的認證和鑒定。這些引物均能在供試油茶樣品中擴增出清晰、穩定、重復性和多態性較高的條帶。

2.2 ISSR多態性分析及指紋分析

用篩選出的23個引物分別對109個油茶種質材料提取的基因組DNA進行PCR擴增，共擴增出487條DNA條帶，平均每個引物擴增出21.2個條帶，其中多態性條帶有335條，平均每個引物擴增出14.6個多態性條帶，平均多態性位點百分率為68.79%，具體見表2。從表2可見，不同引物擴增出的條帶數有較大差異，引物ISSR13，ISSR36擴增出的條帶較多，分別為27、28條；引物ISSR9，ISSR10擴增出的條帶數最少，均為16條。引物ISSR18、ISSR28和ISSR36擴增出的多態性條帶最多，均為20條。用這23條引物分別建立了相應的DNA指紋圖譜，限于篇幅，這里用引物SSR36的擴增結果圖3、圖4作為代表來分析之，其引物擴增效果所反映出的DNA條帶多態性可較好地區分各油茶種質材料。

2.3 油茶品種間的遺傳相似性分析

用NTSYS2.10e軟件計算油茶種質材料間的Dice遺傳相似系數，結果見表3（因篇幅關系，省略了一部分附表，僅以表3為例）。由表3可知，109個油茶種質材料間的遺傳相似系數在0.61～0.93，平均遺傳相似性系數為0.74。以59號樣品（S13）和60號樣品（S12）的遺傳相似性系數最大，為0.93，說明這2個樣品的親緣關系很近，有可能為同一品種。其次是4號樣品（贛無16）和6號樣品（贛無2號），相似性系數為0.87，表明它們之間的親緣關系很接近，遺傳差異較小。而14號樣品（XL53）與15號樣品（湘林210）具有最小遺傳相似性系數，為0.61，可見它們遺傳差異較大，2個樣品間的親緣關系相對較遠。endprint

2.4 聚類分析

在獲得兩兩不同樣品間的Dice遺傳相似系數基礎上，以487個位點的譜帶為原矩陣，采用UPGMA法構建了油茶種質材料間的遺傳關系聚類圖譜，具體見圖5。在圖5聚類分析樹狀結構中，可以看到109個油茶種質材料的分類情況。樹狀圖與種質材料間的遺傳相似系數反映的情況基本一致，即遺傳相似系數越高，親緣關系越近，種質材料間差異就越小。109份種質材料間的相似系數在0.70～0.93，表現出了豐富的遺傳多樣性。

根據油茶ISSR聚類分析結果，說明親緣關系樹狀圖較復雜，當遺傳相似系數為0.70時，109個種質材料可分為A、B兩組，B組中15號樣品湘林210可單獨聚類，說明該種質材料與其他種質材料間存在遺傳差異。

當遺傳相似系數為0.735時，可將油茶種質材料劃分為11個類群。類群I包括的樣品材料較多，有79個。該類群在相似系數為0.75處又可以劃分為7個亞類群。其中亞類群I-1包括14個種質材料，該亞類群又可分為兩個小組，第二小組聚類了6個種質材料，其中有4個是QY系列的；第一小組聚類了8個種質材料，其中來自S系列的59號和60號樣品的遺傳相似性系數最大，為0.93，說明這兩個種質材料的親緣關系很近，有可能為同一品種。亞類群I-2包括27個樣品，有7個是贛系列的。亞類群I-3包括4個種質材料，來自贛無系列的4號和6號樣品聚類在一起，遺傳相似系數為0.87，說明他們的親緣關系接近，遺傳差異較小。亞類群I-4包括湘林7、XL32、QY235、AH12、長林3、QY104這6個種質材料。亞類群I-5包括24個樣品，其中有8個來自贛系列。亞類群I-6只有來自S系列的S8和S6兩個樣品。亞類群I-7只有XLC25和AH19兩個樣品。

類群Ⅱ包括5個種質材料。類群Ⅲ包括4個種質材料，其中有3個是贛系列的。類群Ⅳ包括3個種質材料，其中有2個來自贛系列。類群Ⅴ、類群Ⅵ和類群Ⅶ均包括3個種質材料。而類群Ⅷ和類群Ⅸ分別只有S3、茶花各1個樣品。類群Ⅹ包括6個樣品，其中有5個樣品是XL系列的。類群Ⅺ則只有湘林210這一個樣品。

3 討論

3.1 ISSR標記和引物篩選

遺傳標記是作物遺傳育種研究的重要工具之一，ISSR以其設備技術簡單、重復性高、多態性豐富的特點已在果樹起源進化及系統分類研究方面發揮著重大作用[15]。試驗中由49對引物最終僅篩選出23對多態性高的引物，篩選效率一般，引物篩選率為46.9%，可能來自兩方面的原因，一是EST數據較少，來源單一，所設計的引物本身就存在較高的冗余度；二是中國油茶種質材料之間親緣關系較近，不易得到有多態性的引物[16]。

3.2 遺傳多樣性分析

多態位點百分率是衡量物種遺傳變異水平高低的一個重要指標，是衡量遺傳多樣性的重要參數[17]。張婷等[18]對湖北省5個地區的48個油茶資源進行了遺傳多樣性分析，將湖北省主要油茶栽培品系分為兩大類群，恩施州的鶴峰居群為一類，其他地區居群為一類。

在親緣關系分析方面，Huang等[19]利用RAPD標記技術，用18條引物分析了90個油茶無性系的遺傳多樣性，結果擴增譜帶中的多態性譜帶比率高達95.11%；彭方仁等[20]利用ISSR技術用10個引物對192份油茶種質材料進行了鑒別，結果多態性百分率為88.14%；代惠萍等[21]利用ISSR分子標記技術，用11個引物對秦巴山區的32個油茶品種進行了擴增，結果多態性位點比率為60.28%；本試驗利用ISSR分子標記技術，用23個引物對109個油茶種質材料進行擴增，所得到的多態性比率為68.79%，表明供試油茶種質材料之間存在著較大程度的遺傳變異，具有豐富的遺傳多樣性。這與湖北省油茶種質資源豐富、油茶分布地區廣及油茶長期的異花授粉造成的遺傳背景高度復雜等因素有關。

3.3 油茶親緣關系的聚類分析

試驗發現，聚類分析中部分地理來源相同或遺傳背景相似的種質材料能夠聚在同一類群里，但也有一些地理來源及遺傳背景不一致的種質材料也能聚集在同一類群，顯示出了復雜的親緣關系。可能的原因一是油茶已有悠久的栽培歷史，在長期的生產中，各油茶產區遺傳資源在不斷交流所致[2]；二是種質材料數量不均勻，此次采集的樣品中贛系列有24個，XL系列有20個，長林系列、S系列和AH系列均有10個，QY系列有9個，鄂油系列有8個，其他的更少，甚至有的系列只有1個，如華碩，這導致聚類結果的不規律；三是油茶具有異花授粉的特性，這導致了種質材料高水平的遺傳多樣性[22]。

試驗中，109個油茶種質材料利用 ISSR分子標記得到的聚類分析圖從總體上看似乎有點雜亂，這主要是由于樣品數量繁多所造成的；從單個的油茶品種（優樹）系列來看，贛系列、XL系列、長林系列以及QY系列等能清晰地建立遺傳圖譜，鑒別其親緣關系的遠近。如贛系列中，聚類在亞類群I-3中的贛無16和贛無2號的親緣關系最近，遺傳相似系數為0.87；贛無5、贛無11、贛興46、贛石84-8、贛無24、贛永6和贛無20的親緣關系較近，在亞類群I-2中聚在一起；贛無1、贛68、贛8、贛6、贛70、贛興48、贛190和贛石83-4的親緣關系較近，在亞類群I-5中聚在一起。又如XL系列中，XLC26、XLC4、XL36、XLC6和XLC8的親緣關系較近，在類群X中聚在一起；S系列中，S1、S6、S8、S10、S11、S12、S13和S17的親緣關系較近，在類群I中聚在一起，其中在亞類群I-1中的S13和S12的親緣關系最近，遺傳相似系數為0.93。當然，由于條帶判讀具有主觀性、某些條帶擴增效果不明顯等原因會使鑒定結果可能存在偏差，這需要更多的試驗來驗證。

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