肛洗二號中藥軟膏劑皮膚刺激性考察及質量控制研究?

龐曉晨，成睿珍，李 玥，趙 靜△

(1. 天津市濱海新區中醫醫院，天津 300451； 2. 天津中醫藥大學，天津 300193)

肛洗二號中藥軟膏劑原處方為本院使用多年的肛腸科外用熏洗經驗方，由黃柏、槐花、五倍子、苦參等12味中藥組成，臨床用于治療濕熱瘀阻型混合痔術后的水腫及疼痛，具有清熱解毒、消腫止痛的功效[1-2]。由于此方在使用過程中發現了諸多缺點，故本研究在傳統中醫理論指導下，利用現代制藥技術研究方法，對其制備工藝進行優化研究，在原方的基礎上改良成中藥軟膏劑這一現代藥物劑型。

為確保制劑臨床皮膚用藥的安全性，本研究以SD大鼠為試驗動物，通過皮膚刺激性試驗考察制劑單次和多次給藥，對完整皮膚的刺激性、對其用藥安全性給予客觀評價[3]。為保障該制劑在有效期內的安全有效，制定出科學、合理、可行的質量標準，本試驗采用專屬性較強的超高效液相色譜法，同時測定多種有效成分含量，以外觀性狀、pH值、離心試驗以及含量測定為質量控制指標，對其進行耐冷耐熱、3個月加速試驗和6個月常期試驗等穩定性考察，建立該制劑的質量控制方法，從而為該制劑的進一步開發利用和臨床應用提供理論依據和質量保障。

1 試驗材料

1.1 儀器與試藥

ACQUITY H-Class型超高效液相色譜系統 (美國Waters公司)，XP205型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，DELTTA320 pH計(瑞士梅特勒-托利多公司)，Sorvall ST 16R型高速離心機(德國Thermo Fisher公司)，鹽酸小檗堿、蘆丁、槲皮素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110713-201212，100080-201409，100081-201509)，乙腈、甲酸為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 試驗動物

SD雄性大鼠，體質量200～250 g(合格證號SCXK(軍)2014-001)。

2 方法與結果

2.1 皮膚刺激性試驗[4]

2.1.1 試驗動物處理及分組 給藥前24 h將SD大鼠背部脊柱兩側毛使用8%Na2S溶液脫掉5×5 cm面積，脫毛后用酒精消毒脫毛區皮膚，待脫毛后第2天觀察脫毛區皮膚是否恢復正常，待無任何皮損后開始涂藥。將SD大鼠隨機分為2組各6只，分別為單次給藥組和多次給藥組。

2.1.2 單次給藥的皮膚刺激性試驗 取軟膏劑1 g，空白基質1 g，分別涂在第1組SD大鼠的左側和右側脫毛區內。24 h用無菌溫水清洗藥物和溶劑，觀察皮膚是否有紅斑、水腫反應，觀察時間1～72 h。

2.1.3 多次給藥的皮膚刺激性試驗 取軟膏劑1 g、空白基質1 g分別涂在第2組SD大鼠的左側和右側脫毛區內，固定涂敷6 h后用溫水去除脫毛部位殘留藥物，每天涂1次，連續涂7 d，末次涂藥后6 h用溫水去除殘留藥物，1 h后觀察皮膚有無紅斑、水腫。然后繼續每天觀察皮膚情況，連續1周皮膚狀況。

2.1.4 皮膚刺激性試驗結果 按皮膚刺激性反應和強度評分標準判斷、觀察皮膚反應，主要考查皮膚紅斑和焦痂程度及皮膚水腫程度2項指標，對皮膚刺激性進行評分[5-7]。結果顯示，軟膏劑和空白基質對大鼠完整皮膚用藥部位均未見紅斑、水腫等刺激反應，各組在72 h內各個不同時間點剌激反應平均分值均為0，均未出現皮膚刺激性反應。

2.2 質量控制

2.2.1 性狀 本品為棕色或深棕色半固體，質地均勻、稠度適宜，容易涂展。

2.2.2 pH值 取本品0.5 g加蒸餾水10 ml，超聲使溶解放至穩定，補重、過濾、測量，pH值應在6.5～7.5之間[8]。

2.2.3 離心試驗 取3批樣品各2 g置于10 ml離心管中，離心30 min (3000 r/min)，3批樣品應均無分層現象。

2.2.4 含量測定 檢測指標為制劑原處方的君藥和臣藥中黃柏和槐花的主要有效成分鹽酸小檗堿、蘆丁和槲皮素，樣品含量以相當于標示量的百分含量表示，本品含量應為標示量的90%～110%[9]。

(1)色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流動相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)梯度洗脫(0～6 min，15% A; 6～7 min，15%～25% A; 7～13 min，25% A; 13～16 min，25%～70% A)，流速0.3 mL·min-1，檢測波長260 nm，柱溫30 ℃，進樣量2 μL。

(2)混合對照品溶液的制備：依次精密稱取10.08 mg蘆丁、5.05 mg鹽酸小檗堿和5.11 mg槲皮素對照品，將其置于同一50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度即得。制成每1 mL含有蘆丁、鹽酸小檗堿和槲皮素分別為201.6 μg、101.0 μg和102.2 μg的混合對照品貯備液。

(3)供試品的制備：稱取適量制劑于50 mL容量瓶中，加入甲醇超聲溶解，全部溶解后用甲醇定容，取出部分溶液于離心機內10000 rpm離心10 min，取上清液經0.20 μm 有機濾膜過濾即得。

(4)標準曲線的制備：以蘆丁含量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線得回歸方程(Y=13006x-15688)，線性范圍為(4.03～160.28 μg，r=0.9999)；以小檗堿含量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線得回歸方程(Y=25602x-15123)，線性范圍為(2.02～80.80 μg，r=0.9999)；以槲皮素含量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程(Y=24824x-13535)，線性范圍為(2.04～81.76 μg，r=0.9999)。結果表明，本法對3個被檢測成分的線性關系良好。

(5)精密度試驗：精密吸取低、中、高濃度的蘆丁、鹽酸小檗堿和槲皮素對照品溶液，連續進樣5次、連續進樣3 d測定峰面積，計算日內、日間精密度。結果表明，蘆丁、鹽酸小檗堿和槲皮素日內、日間精密度RSD均小于2%，儀器精密度良好。

表1 精密度-蘆丁日內、日間精密度比較

(6)穩定性試驗：取同一供試品0.5 g，加入甲醇超聲溶解后，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h各進樣2 μL，測定蘆丁、鹽酸小檗堿和槲皮素濃度值的RSD分別為1.91%，1.14%和1.69%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

(7)重復性試驗：取同一供試品0.5 g共6份，加入甲醇超聲溶解后進行含量測定。結果蘆丁、鹽酸小檗堿和槲皮素的平均濃度值分別為89.73 μg·mL-1、14.00 μg·mL-1和6.81 μg·mL-1，RSD分別為0.97%、0.93%和1.09%，表明該方法重復性良好。

(8)加樣回收率試驗：精密稱取同一供試品0.5 g共6份，加入甲醇超聲溶解后，分別精密加入適量蘆丁、鹽酸小檗堿和槲皮素對照品進樣測定，計算加樣回收率。結果表明，蘆丁、鹽酸小檗堿和槲皮素平均回收率分別為101.52%、99.60%和100.65%，RSD均小于2%。

(9)3批樣品驗證試驗：取3批樣品精密稱取0.5 g，加入甲醇超聲溶解后，分別測定鹽酸小檗堿、蘆丁和槲皮素的峰面積。結果表明，蘆丁的含量分別為139.93、149.61、149.40 μg·g-1，鹽酸小檗堿的含量分別為21.27、22.63、22.57 μg·g-1，槲皮素的含量分別為10.18、11.06、11.13 μg·g-1，樣品含量以相當于標示量的百分含量表示，本品含量為標示量的99%～100%均符合要求。

表2 含量測定結果

2.3 穩定性研究[10]

2.3.1 耐冷及耐熱性試驗 表3顯示，分別稱取3批樣品模擬上市包裝，分別置于(-15±2)℃ 冰箱24 h和(55±2)℃恒溫箱6 h，取出恢復室溫，觀察制劑外觀性狀變化及各項指標。結果表明，在上述條件下，外觀無明顯變化，各項指標基本保持不變，均符合質量控制標準，提示在市售包裝條件下本品穩定性良好。

表3 3批樣品耐冷、耐熱性試驗

2.3.2 加速試驗 表4顯示，分別稱取3批樣品模擬上市包裝，置于恒溫箱(37±2 ℃、RH 75±5%)中，分別于0、1、2、3個月取樣，觀察制劑外觀性狀變化及各項指標。結果表明，在上述條件下，3個月內外觀無明顯變化，各項指標基本保持不變，符合質量控制標準，提示在市售包裝條件下本品穩定性良好。

表4 3批樣品加速試驗結果

2.3.3 常期試驗 表5顯示，分別稱取3批樣品模擬上市包裝，室溫放置，分別于0、1、3、6個月取樣，觀察制劑外觀性狀變化及各項指標。結果表明，在上述條件下，6個月內外觀無明顯變化，各項指標基本保持不變，符合質量控制標準，提示在市售包裝條件下本品穩定性良好。

3 討論

痔瘡是最常見的肛腸疾病，包括內痔、外痔和混合痔。隨著社會節奏的加快，人們生活、飲食習慣的不合理，痔瘡發病率逐年增長，越來越多的人被痔瘡、肛瘺等肛腸疾病所困擾[11]。原處方主要由五倍子、苦參、黃柏、槐花、乳香、沒藥等12味中藥材組成，是臨床用于濕熱瘀阻型混合痔術后患者熏洗的經驗方，具有消腫止痛、清熱解毒、活血化瘀、斂瘡生肌的功效，對于混合痔術后緩解水腫及疼痛有著顯著的療效。中藥軟膏劑是中醫藥學的一種獨特的外治療法，充分顯示了中醫藥的優勢[12]。

表5 3批樣品常期試驗結果

中醫學認為外用藥物貼近皮膚，通過皮膚、肌肉紋理將藥物的性味傳入臟腑，扶正祛邪，從而治愈疾病，即“藥達病所，投之可至”[13]。該制劑直接作用于痔瘡部位，副作用小，作用時間長，同時具有易于涂布、性質穩定等特點，在保護創面的同時實現了與外界環境隔離[14]。透皮給藥制劑同時具有延長有效作用時間、維持恒定的最佳血藥濃度、減少給藥頻率、改善患者用藥順應性、減少胃腸給藥副作用，提高藥物的生物利用度的優點，同時可以避免肝臟的“首過效應”對胃腸道造成的破壞。

中藥制劑特別是中藥復方制劑的皮膚刺激性試驗研究是透皮制劑研究以及新藥臨床前安全性評價的重要組成部分[15]。很多研究報道也都將皮膚刺激性試驗作為透皮制劑的重點研究內容之一[16-18]。本研究以大鼠為試驗動物，考察該透皮制劑單次和多次給藥對完整皮膚的刺激性。皮膚刺激性試驗結果表明，單次和多次給藥對正常皮膚均未造成紅斑和水腫現象，刺激評分均為零。

另外，中藥復方制劑的質量控制也是目前現代制劑開發應用過程中研究的熱點[19]。只有建立起較為完整的中藥復方制劑質量控制方法，確定質量控制標準，才能更加有效地發揮藥物的藥效，保障制劑的臨床療效。本研究通過初步穩定性實驗考察，在耐寒耐熱、高濕、高溫和離心等條件下，制劑性狀穩定、無沉積、分層等現象，pH值、離心試驗以及藥物含量也無明顯變化。

綜上所述，該制劑成品穩定性好、質量可控，且無皮膚刺激性，符合臨床治療需要，適合于臨床應用和推廣，具有很好的開發前景。

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