桑抹茶對高脂血癥模型大鼠胸主動脈LXRα、PPAR蛋白表達的作用研究*

樓招歡李波俞靜靜呂圭源

1 浙江中醫藥大學 浙江 杭州 310053

2 浙江省中藥治療高血壓及相關疾病藥理研究重點實驗室 浙江 杭州 310053

桑抹茶是新鮮桑葉經特殊抹茶工藝制成的天然超細粉末，前期研究顯示其具有良好的降血脂作用，并具有促進膽固醇逆轉運潛能[1]。本文擬進一步觀察桑抹茶對高脂血癥模型大鼠胸主動脈形態及膽固醇流出相關蛋白表達的影響，探討其抗動脈粥樣硬化的作用及可能機制。

1 實驗材料

1.1 動物：SD大鼠，雄性，體重200±20g，40只，由浙江省醫學科學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（浙）2014-0001，動物合格證號：NO.0016674。于室溫23±2℃，相對濕度50%～70%飼養，自由飲食飲水。

1.2 藥物與試劑：阿托伐他汀（Atorvastatin Calcium Capsules，河南天方藥業股份有限公司131010109，10mg/粒），臨用前用蒸餾水配制成濃度為0.6mg/mL的混懸液。桑抹茶由新鮮桑葉冷凍干燥后經球磨機碾碎成超細粉末，臨用前取上述樣品適量，用純水配置成90、60、30mg/ml的混懸液，即得。膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒均購自寧波美康生物科技有限公司；一氧化氮試劑盒（NO，20151228，南京建成科技有限公司）；DAPI、FITC標記山羊抗兔IgG（H+L）(A0562，碧云天)；免疫組化二抗試劑盒（ab64264，abcam公司）；肝X受體α（LXRα；YT5143，Immuno Way）、過氧化物酶體增殖物激活受體α/γ（PPARα/γ；15540-1-AP，Proteintech和YM3443，Immuno Way）、高脂飼料購自特洛菲飼料科技有限公司。

1.3 儀器：ACCUTE TBA-40FR全自動生化分析儀（東芝三廠醫療株式會社）；Power wave 340酶標儀（美國Bio-TEK儀器有限公司）；SAKURA Tissue-Tek VIP 5Jr自動脫水機，日本櫻花檢驗儀器株式會社；MEIKO EC360包埋機，德國MEIKO公司；LEICARM2245切片機，德國LEICA公司；生物顯微鏡BA410，Motic公司；Adavance 3.2圖像分析系統，Motic公司。

2 實驗方法

2.1 分組與給藥：將大鼠適應性喂養7d后，稱定體質量，隨機分為正常對照組和造模組，除正常對照組大鼠外，其余大鼠給予高脂飼料，2周后禁食12h后眼眶靜脈叢采血，測定血清中TC水平，根據TC水平隨機分為5組：正常對照組、模型對照組、陽性對照組（阿托伐他汀6.0mg/kg）、桑抹茶組(900、600、300mg/kg)，每組8只。所有大鼠均給予高脂飼料，連續4周，自由采食飲水。同時除正常對照組和模型對照組灌服蒸餾水外，其余各給藥組分別灌胃給予相應劑量的藥物，每日1次，灌胃容積為1ml/100g體質量，連續4周。

2.2 血脂水平檢測：于給藥后第4周眼眶取血（取血前禁食不禁水12h），37℃水浴1h，3500r/min，離心10min，取上清液即血清，全自動生化分析儀檢測大鼠血清血脂生化指標（TC、TG、LDL-C、HDL-C），并計算動脈硬化指數（AI=(CTC-CHDL-C)/CHDL-C）。

2.3 血清一氧化氮水平檢測：實驗期末，眼眶采血，37℃水浴1h，3500r/min，離心10min，取上清，按照說明書采用硝酸還原酶法測定血清中NO水平。

2.4 HE染色觀察胸主動脈組織病理學：各組大鼠解剖后取胸主動脈相同部位，4%中性福爾馬林緩沖溶液固定72h，常規脫水，石蠟包埋，切片、HE染色，中性樹脂封片，光鏡下觀察組織病理學改變。

2.5 主動脈PPARγ/α、LXRα表達的檢測：采用免疫組化法和免疫熒光法。主動脈石蠟切片免疫組化DAB顯色法：梯度二甲苯脫蠟→梯度乙醇水化→抗原修復→滅活內源性過氧化氫酶→5%BSA封閉→孵育抗PPARγ/α、LXRα一抗或PBS→孵育二抗→DAB顯色→蘇木素染核→脫水→二甲苯透明→封片→鏡下觀察，黃色為陽性表達結果；同時設置PBS代替抗PPARγ/α、LXRα一抗的同步陰性對照。石蠟切片PPARγ免疫熒光染色：梯度二甲苯脫蠟→梯度乙醇水化→抗原修復→5%BSA封閉→孵育PBS或抗PPARγ一抗→孵育FIFC標記的熒光二抗→DAP1染核→防熒光淬滅封片劑封片→熒光倒置顯微鏡下觀察；綠色熒光為PPARγ陽性表達，藍色熒光為細胞核的表達。

3 實驗結果

3.1 對血脂水平的影響：圖1結果顯示，與正常組比較，給予高脂飼料2w后，各模型組大鼠血清TC、LDL-C水平顯著升高（P＜0.01），HDL-C水平顯著降低（P＜0.01），動脈粥樣硬化指數AI顯著增大（P＜0.01）；各造模組大鼠TG水平有增高趨勢，但各組間無顯著性差異（P＞0.05）。給予桑抹茶（FM）干預4w后，與模型組比較，FM各劑量組大鼠血清TC、LDL-C水平及AI均顯著下降（P＜0.01，P＜0.05），0.9、0.6g/kg能顯著增加模型大鼠血清HDL-C水平（P＜0.05，P＜0.01）；各組間TG水平無顯著性差異。

3.2 對模型大鼠胸主動脈病變及血清NO水平的影響：HE染色表明，正常組大鼠胸主動脈壁由三層組成，內膜層有豐富的內皮細胞；中膜較厚，由多層彈性膜組成，彈性膜間有平滑肌、少量膠原纖維和彈性纖維；外膜較薄，由結締組織構成；與正常組比較，模型組大鼠主動脈內皮細胞有脫落，彈性膜層排列紊亂，中膜增厚，并有輕微的早期脂紋。與模型組比較，FM各劑量組胸主動脈內膜脫落減輕，彈性膜層排列較整齊，中膜增厚有改善（圖3A）。ELISA結果顯示，與正常組比較，模型大鼠血清NO水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，FM0.9g/kg和0.6g/kg能顯著升高血清NO水平（P＜0.01）（圖3B）。

圖1 造模2周各組大鼠血脂水平

圖2 給藥4周各組大鼠血脂水平

圖3 A：胸主動脈HE染色代表性顯微圖片（200×）；B：各組血清NO水平

3.3 對主動脈PPARγ/α、LXRα蛋白表達的影響：免疫組化結果表明，PPARγ/α、LXRα在主動脈細胞核表達（見圖4、5）；PPARγ免疫組化DAB顯色法和免疫熒光的結果類似（見圖5）。與正常對照組比較，模型組大鼠主動脈PPARγ、LXRα表達明顯降低，PPARα有升高趨勢，但無顯著性差異；與模型對照組比較，FM各劑量組大鼠主動脈PPARγ、LXRα表達有增加趨勢，PPARα有降低趨勢，其中對LXRα和PPARα的作用以0.3g/kg劑量較為顯著，對PPARγ的作用以0.9、0.6g/kg劑量較為明顯。

圖4 主動脈PPARα、LXRα表達代表性顯微圖片（DAB染色，200×）

圖5 主動脈PPARγ表達代表顯微圖片（A：DAB染色，200×；B：熒光染色，200×）

4 討論

AS是心腦血管病的病理基礎，已知血脂代謝異常是其重要誘因。由異常升高的LDL氧化修飾形成的氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），侵入并沉積于血管內膜，損傷內皮細胞，觸發炎癥反應，由單核細胞黏附并活化的巨噬細胞通過清道夫受體吞噬ox-LDL形成泡沫細胞，促進了AS的發生發展。本文研究結果顯示，與正常組比，模型大鼠給予高脂飼料6w后，血清中TC、LDL-C水平及AI顯著升高，血管內皮細胞有脫落，單核細胞黏附于內膜，中膜增厚；給予FM干預，能有效降低TC、LDL-C及AI，改善內膜損傷，提示FM有一定的預防AS作用。

血管內皮功能紊亂是AS心血管病理生理改變的始動因素。內皮細胞中內皮型一氧化氮合酶（eNOS）產生的NO，具有舒張血管、抗炎、抗血栓等作用，血管內皮細胞釋放NO的減少，可導致血管舒縮功能紊亂，促進AS及高血壓等的發生發展。研究表明，高脂血癥可抑制eNOS的表達，減少NO的合成與釋放[2]，降低血中NO濃度，減弱其抗AS的作用[3]。本文研究結果表明，模型大鼠血清NO水平顯著降低，而不同劑量FM干預，能顯著升高血清NO的含量，減輕主動脈病理改變程度。

肝X受體（LXRs）是一種氧化型固醇激活的核受體，其在膽固醇逆轉運、糖代謝及炎癥過程中起了重要作用，LXRα為其亞型之一。以往研究顯示，LXRs通過調控靶基因ApoE、ABCA1、ABCG1等，促進膽固醇從細胞內流向細胞膜并轉運至細胞外，阻止膽固醇在血管壁等過多的堆積，防止AS的發生發展。此外，LXRs與PPAR通路偶聯，PPARγ通過降低清道夫受體（SR-A）的表達、增強CLA/SR-BI、ABCA1、LXR的表達，促進細胞內膽固醇流出，對泡沫細胞形成負性調節作用；此外，PPARγ表達上調在AS發生的最早期，可以通過抑制血管壁上單核/巨噬細胞介導的炎癥反應來阻斷AS的發生發展。本文研究結果顯示，模型大鼠胸主動脈LXRα、PPARγ表達量明顯低于正常組大鼠，給予FM干預，能有效增加模型大鼠血管LXRα、PPARγ表達量。提示，FM可能可以通過活化LXRα、PPARγ，促進血管壁巨噬細胞膽固醇流出，從而防止血管壁脂質沉積。

綜上所述，桑抹茶通過降低高脂血癥模型大鼠血清TC、LDL-C水平，增加血清NO水平及血管LXRα/PPARγ表達，促進膽固醇流出，改善血管內皮功能，具有潛在的抗AS作用。

[1]樓招歡，張光霽，蘇潔，等.抹茶和桑抹茶對高脂血癥模型大鼠血脂水平的作用[J].中成藥，2016，38（7）：1594-1598.

[2]Sandoo A，van Zanten JJ，Metsios GS，et al.The end o the lium and its role in regulating vscular tone[J].Open Cardiovase Med J，2010，4：301-312.

[3]邊寧，龔博君，郭軍，等.一氧化氮/誘導型一氧化氮合酶在動脈粥樣硬化過程中的作用[J].中國病理生理雜志，2014，33（3）：414-418.