巨大芽孢桿菌對羽葉鬼針草富集土壤鉛的影響

溫 泉，劉 淼，宋俊德，賈 威，馮 璐，戴栗紅

(遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧錦州 121001)

土壤是人類獲取食物和其他再生資源的物質(zhì)基礎(chǔ)[1]，是人類賴以生存的重要自然環(huán)境，無論在中國還是在世界范圍內(nèi)，人們面臨的糧食、資源和環(huán)境問題與土壤密切相關(guān)[2]。截至2010年，在我國有超過2 000萬hm2的農(nóng)田被錫(Sn)、鉻(Cr)、鉛(Pb)、鋅(Zn)等重金屬污染，大約占耕地總面積的1/5，導(dǎo)致每年由于重金屬污染所損失的糧食量達(dá)到了 1 000萬t[3]。2016年5月28日，《土壤污染防治行動(dòng)計(jì)劃》(簡稱“土十條”)出臺(tái)，表明土壤污染治理與修復(fù)是今后環(huán)境保護(hù)和綜合治理的重點(diǎn)任務(wù)之一[4]。

植物修復(fù)技術(shù)是以忍耐和超量積累某種或某些污染物的理論為基礎(chǔ)，利用植物及其共存微生物體系清除環(huán)境中污染物的一類環(huán)境污染治理技術(shù)[5-7]，主要是通過超富集植物將土壤中的重金屬提取出來，并搬運(yùn)到植物根部可收割部分和植物地上的枝條部位。目前已經(jīng)篩選到一些超富集的植物，如蜈蚣草(PterisvittataL.)[8]、東南景天(Sedumalfredii)[9]、印度芥菜(Brassicajuncea)[10]等，在超富集植物中，羽葉鬼針草(Bidensmaximowicziana)[11]能大量富集Pb，并且生物量較大，在植物修復(fù)中具有一定的潛力，但是目前很少有關(guān)于用微生物來提高羽葉鬼針草吸附Pb的報(bào)道。因此，本研究以1種重要的功能菌——巨大芽孢桿菌作為研究對象，研究不同添加量的巨大芽孢桿菌對羽葉鬼針草吸附土壤重金屬Pb的影響，以期為微生物促進(jìn)植物修復(fù)重金屬污染土壤提供一種新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

羽葉鬼針草種子，采自鉛鋅尾礦廢棄地上的自然物種，經(jīng)采集后獲得種子。試驗(yàn)土壤，采自遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園，試驗(yàn)用土經(jīng)風(fēng)干后過篩，重金屬以硝酸鉛的形式施入土壤中，使土壤中的鉛含量為400 mg/kg，于室溫下平衡1個(gè)月后備用。

巨大芽孢桿菌，購自中國微生物保藏中心，將其在LB培養(yǎng)基(含5 g/L酵母提取物、10 g/L蛋白胨、10 g/L氯化鈉、15 g/L 瓊脂，pH值7.0)平板上活化，然后再接種于LB液體培養(yǎng)基上擴(kuò)增，使其最終菌液濃度為1×109CFU/mL，備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用塑料花盆作為種植容器，其上緣直徑為 15 cm，底面直徑為10 cm，高度為15 cm。每盆裝土2 kg，同時(shí)每盆加入0.3 g尿素、0.5 g磷酸二氫鉀作為肥料，將肥料加入土壤中進(jìn)行攪拌，并加入水，使其含水量為田間持水量的50%，平衡10 d后，將羽葉鬼針草種子播種于土壤中，生長 10 d 后，每盆保留3株苗，在羽葉鬼針草生長30 d后接種微生物，分別將20、40、60 mL含菌量為1×109CFU/mL的巨大芽孢桿菌用水稀釋到300 mL，然后噴灑到花盆中，其中S1、S2、S3處理添加的菌液量分別為20、40、60 mL，以不加微生物的處理作為對照組(CK)。試驗(yàn)時(shí)間為2016年4月至7月。

1.3 樣品采集與分析

生長70 d后，收割羽葉鬼針草地上部、地下部，測定鮮質(zhì)量，將地上部、地下部用自來水沖洗凈，再放入烘干箱中，于105 ℃殺青30 min，75 ℃烘干至恒質(zhì)量，磨碎后放入自封袋中備用。收集根系附近土壤，自然風(fēng)干、研磨后過100目篩備用。土壤中鉛的有效態(tài)按土壤BCR方法[12]進(jìn)行分級(jí)提取，植物和土壤中鉛含量用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)測定。可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法測定(以鮮質(zhì)量計(jì))，過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定(以鮮質(zhì)量計(jì))。對于土壤中有機(jī)酸含量，將土壤樣品依次用去離子水、三氯甲烷萃取后，用氣相色譜(安捷倫7890)進(jìn)行測定。

植物的富集系數(shù)以及土壤形態(tài)學(xué)中歐洲共同體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)局(BCR)規(guī)定的各態(tài)所占的比例計(jì)算公式分別如下：

W=C1/C2；

Z=(T1/T0)×100%。

式中：W為生物富集系數(shù)；C1為植物體內(nèi)鉛含量，mg/kg；C2為植物根系附近土壤中鉛含量，mg/kg；Z為BCR各態(tài)所占比例，%；T1為各態(tài)的重金屬含量，mg/kg；T0為各態(tài)的總含量，mg/kg。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對羽葉鬼針草生物量的影響

由圖1可以看出，在不添加微生物的情況下，羽葉鬼針草的生物量為7.6 g；當(dāng)添加20 mL微生物時(shí)(S1處理)，羽葉鬼針草的生物量為8.0 g，比對照組增加了5.3%；進(jìn)一步添加微生物量為40 mL時(shí)(S2處理)，羽葉鬼針草的生物量提高更多(9 g)，比對照組增加了18.4%；當(dāng)微生物投加量達(dá)到 60 mL 時(shí)(S3處理)，羽葉鬼針草的生物量比對照組增加了21%，但相對于40 mL的微生物投加量，其生物量增加變緩。總體看出，微生物的添加有利于羽葉鬼針草在受重金屬污染土地上的生長。

2.2 不同處理對羽葉鬼針草內(nèi)部分生理生化指標(biāo)的影響

可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，包括各種酶分子以及代謝調(diào)節(jié)物，可溶性蛋白含量的增加和積累能提高細(xì)胞的保水能力，顯示了機(jī)體的代謝和葉片的生命活動(dòng)旺盛程度。由表1可看出，添加微生物后都能提高可溶性蛋白的含量，說明微生物的增加可提高羽葉鬼針草的代謝活性。SOD是一種重要的活性氧防御酶，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。POD是一種含F(xiàn)e的金屬蛋白質(zhì)，催化過氧化氫類的反應(yīng)，廣泛參與植物的物質(zhì)和能量代謝，在植物的呼吸代謝和抗性生理中起重要作用。從SOD比活力和總活性可看出，CK>S2>S3>S1，說明S2處理對于羽葉鬼針草的SOD影響最小，并從POD活性看出，S2>S3>S1>CK，說明菌株的添加都可提高羽葉鬼針草的新陳代謝速度。綜合各植物各生理生化指標(biāo)，可看出S2處理對于羽葉鬼針草的生長有著最佳的促進(jìn)作用。

表1 不同處理羽葉鬼針草內(nèi)的生理生化指標(biāo)

2.3 不同處理對羽葉鬼針草吸附鉛的影響

由圖2可見，CK、S1、S2、S3處理下羽葉鬼針草地下部分鉛含量分別為330、410、530、568 mg/kg，地上部分鉛含量分別為520、630、800、850 mg/kg。可見羽葉鬼針草對重金屬鉛有很好的吸收與耐受能力，并且地上部分的鉛含量都要高于地下部分的鉛含量，這說明羽葉鬼針草對于鉛具有較強(qiáng)的向地上部運(yùn)輸?shù)哪芰Γm合用于土壤重金屬的提取。此外相對于對照組，添加微生物后的S1、S2、S3處理組的地下部分鉛含量分別提高了24.2%、60.6%、72.1%，而地上部分鉛含量分別提高了21.2%、53.8%、63.5%，說明微生物可以促進(jìn)羽葉鬼針草吸收土壤中的鉛。

羽葉鬼針草地上部(地下部)生物富集系數(shù)是用羽葉鬼針草地上部(地下部)對鉛的吸收量與土壤中鉛含量的比值計(jì)算得到的。由圖3可知，S1、S2、S3處理羽葉鬼針草地上部分生物富集系數(shù)分別為1.6、2.0、2.1，相對于對照組分別提高了15.3%、53.8%、61.5%；S1、S2、S3處理羽葉鬼針草地下部分生物富集系數(shù)分別為1.0、1.3、1.4，相對于對照組分別提高了25.0%、62.5%、75.0%。由此可看出，接種微生物的羽葉鬼針草對于鉛的富集效果要明顯好于未接種微生物的，并且隨著微生物添加量的提高，生物富集系數(shù)也在不斷提高，在 40 mL 添加量時(shí)(S2處理)增幅最明顯，進(jìn)一步提高微生物的濃度，生物富集系數(shù)的提高幅度開始變緩。

2.4 不同處理對土壤有效鉛含量的影響

羽葉鬼針草對土壤鉛的吸收主要取決于土壤中鉛的價(jià)態(tài)，在鉛的各價(jià)態(tài)中，弱酸提取態(tài)是指鉛在土壤中容易遷移的價(jià)態(tài)，該價(jià)態(tài)的鉛容易被植物吸收進(jìn)入體內(nèi)。由圖4可以看出，經(jīng)過菌液處理后的S1處理，其土壤中弱酸提取態(tài)鉛含量為17%，較CK處理增加了4百分點(diǎn)，而殘?jiān)鼞B(tài)鉛含量由CK處理的40%降低到37%。隨著菌液量的進(jìn)一步增加，S2、S3處理的弱酸提取態(tài)鉛含量與CK相比分別提高了10%、12%，殘?jiān)鼞B(tài)鉛含量分別降低了8%、10%，而可還原態(tài)、可氧化態(tài)的鉛含量變化不明顯。結(jié)果表明，菌株進(jìn)入土壤中后，有利于土壤中的鉛從殘?jiān)鼞B(tài)向弱酸提取態(tài)轉(zhuǎn)變，這可能主要是由于菌株進(jìn)入土壤后會(huì)通過自身的代謝活動(dòng)直接或間接活化土壤中的鉛，從而有利于羽葉鬼針草對于土壤中鉛的吸收。此外，加入菌株還會(huì)刺激羽葉鬼針草根系附近的微生物，有助于活化重金屬鉛，并在一定程度上促進(jìn)了植物的生長。而從微生物的投加量來看，隨著微生物投加量提高到40 mL，羽葉鬼針草的生物量和吸收鉛含量的提升效果最明顯；進(jìn)一步提高微生物的投加量，植物的生物量和鉛吸收量增幅變緩，這說明40 mL的微生物量已足夠強(qiáng)化羽葉鬼針草吸收土壤中的鉛。

2.5 巨大芽孢桿菌對根系土壤有機(jī)酸含量的影響

土壤中低分子量的有機(jī)酸主要來源于植物根系的分泌物以及土壤微生物的代謝。各處理組在試驗(yàn)70 d后，收獲植物根系附近的土壤進(jìn)行有機(jī)酸含量的測定。由表2可以看出，添加微生物的各處理組對于乳酸含量的影響不大，基本沒有變化。對于丙二酸含量來說，添加微生物各處理組稍有增加，但幅度也不是很大，可能是其他代謝產(chǎn)物刺激引起的。添加微生物各處理組的蘋果酸、酒石酸含量增加較大，S1、S2、S3處理的蘋果酸含量分別是對照組的3.1、12.5、10.6倍，相應(yīng)的酒石酸含量分別是對照的3.9、19.2、10.6倍。可見，添加微生物可以有效提高根系土壤中蘋果酸、酒石酸的含量，其中有機(jī)酸含量最高的是S2處理，而添加高濃度微生物的S3處理的含量反而低于S2處理，可能是高濃度菌液會(huì)在一定程度上抑制根系或土壤微生物分泌有機(jī)酸，但是添加巨大芽孢桿菌都可提高有機(jī)酸含量，從而有利于活化重金屬，促進(jìn)植物對于重金屬的吸收。

表2 根系土壤中有機(jī)酸含量分析

3 結(jié)論

巨大芽孢桿菌對羽葉鬼針草修復(fù)鉛污染土壤有促進(jìn)作用，S1、S2、S3處理的羽葉鬼針草生物量增加，與對照組相比，其地下部分鉛含量分別提高了24.2%、60.6%、72.1%，而地上部分鉛含量分別提高了21.2%、53.8%、63.5%，究其原因主要是添加菌株會(huì)提高土壤中蘋果酸、酒石酸的含量，從而促進(jìn)土壤中鉛的價(jià)態(tài)從殘?jiān)鼞B(tài)向弱酸提取態(tài)轉(zhuǎn)化，并在一定程度上提高了根系微生物的活性，從而使得羽葉鬼針草更容易吸收土壤中的鉛。

[1]劉秀梅，聶俊華，王慶仁.植物修復(fù)重金屬污染土壤的研究進(jìn)展[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，36(1)：8-13.

[2]顧繼光，周啟星，王 新.土壤重金屬污染的治理途徑及其研究進(jìn)展[J].應(yīng)用基礎(chǔ)與工程科學(xué)學(xué)報(bào)，2003，11(2)：143-151.

[3]孫鵬軒.土壤重金屬污染修復(fù)技術(shù)及其研究進(jìn)展[J].環(huán)境保護(hù)與循環(huán)經(jīng)濟(jì)，2012(11)：48-51，75.

[4]吳耀楣.中國土壤重金屬污染修復(fù)技術(shù)的專利文獻(xiàn)計(jì)量分析[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2013，22(5)：901-904.

[5]溫志良，毛友發(fā)，陳桂珠.重金屬污染生物恢復(fù)技術(shù)研究[J].環(huán)境科學(xué)動(dòng)態(tài)，1999(3)：15-17，14.

[6]Cunningham S D，Berti W R，Huang J W.Phytoremediation of contaminated soils[J].Trends in Biotechnology，1995，13(9)：393-397.

[7]張慧智，劉云國，黃寶榮，等.錳礦尾渣污染土壤上植物受重金屬污染狀況調(diào)查[J].生態(tài)學(xué)雜志，2004，23(1)：111-113.

[8]陳同斌，韋朝陽，黃澤春，等.砷超富集植物蜈蚣草及其對砷的富集特征[J].科學(xué)通報(bào)，2002，47(3)：207-210.

[9]張富運(yùn)，陳永華，吳曉芙，等.鉛鋅超富集植物及耐性植物篩選研究進(jìn)展[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32(12)：92-96.

[10]楊 卓，韓德才，李博文.不同栽培條件下印度芥菜對重金屬的吸收比較[J].環(huán)境科學(xué)研究，2014，27(3)：295-300.

[11]王紅旗，李 華，陸泗進(jìn).羽葉鬼針草對Pb的吸收特性及修復(fù)潛力[J].環(huán)境科學(xué)，2005，26(6)：143-147.

[12]張朝陽，彭平安，宋建中，等.改進(jìn) BCR 法分析國家土壤標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中重金屬化學(xué)形態(tài)[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2012(11)：1881-1884.