油茶產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的誘變育種

張 婷，左雪枝

(荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北荊門 448000)

植物內(nèi)生真菌存在較為廣泛，無論是陸地植物還是水生植物，在它們體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生真菌。植物體內(nèi)的內(nèi)生真菌種類也是不唯一的，有些植物中內(nèi)生真菌多達(dá)幾百種，據(jù)統(tǒng)計(jì)平均每種寄主有4～5種寄生菌[1-2]。內(nèi)生真菌不僅分布廣、種類多，而且具有特殊的代謝產(chǎn)物，很多代謝產(chǎn)物具有促進(jìn)植物生長、殺蟲、抗菌、抗氧化等作用[3]。

油茶(Camelliaoleifera)在我國南方具有悠久的栽培和利用歷史，油茶屬于山茶科山茶屬中一類含有較高油脂的油料物種[4]。油茶蒲的提取物含有豐富的生物活性物質(zhì)，具有抗癌、減肥降脂、降血糖、改善良性前列腺增生等生物活性[5]。試驗(yàn)前期已從油茶中分離出多種內(nèi)生真菌，并對內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步研究發(fā)現(xiàn)，一些可以產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌中，JS-Ye6菌株產(chǎn)黃酮能力最強(qiáng)，但其產(chǎn)黃酮的能力仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求，因此希望通過對JS-Ye6菌株進(jìn)行誘變處理使其產(chǎn)生基因突變，獲得產(chǎn)黃酮能力較高的正突變菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

JS-Ye6菌株(實(shí)驗(yàn)室保存)；蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品和其他分析純化學(xué)試劑[乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸(簡稱EDTA)、瓊脂粉、冰乙酸、無水乙酸鈉、乙酸乙酯]均購自湖北省荊州市昌華科教儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌絲懸液的制備 將保存的菌株接種于PDA平板培養(yǎng)3～4 d，選取PDA培養(yǎng)基上生長較旺盛的菌落，用接種環(huán)將菌絲體挑下，接入裝有少量已滅菌玻璃珠的PDA液體培養(yǎng)基(50 mL/150 mL)中，28 ℃ 150 r/min搖床培養(yǎng)48 h，吸取液體培養(yǎng)基稀釋至10-4，得到菌絲懸液。

1.2.2 菌株的誘變 參照崔迎的誘變方法[6]進(jìn)行菌株誘變。先進(jìn)行單因素誘變[紫外線(UV)誘變和亞硝酸(HNO2)誘變]，確定單因素誘變中的最佳正突變菌株，再進(jìn)行復(fù)合誘變。

1.2.3 菌株的初篩 誘變處理的菌液在培養(yǎng)時，每天都要觀察其生長狀態(tài)。當(dāng)有較多菌落長出時，分別記錄誘變組菌落的數(shù)量和對照組菌落的數(shù)量，通過致死率確定較優(yōu)劑量范圍[致死率=(1-誘變后活菌菌落數(shù)/對照組菌落數(shù))×100%]。待較優(yōu)劑量范圍內(nèi)的菌落完全長出后，取等量菌塊，轉(zhuǎn)接于新PDA平板的中心位置，以菌落生長速度和大小為指標(biāo)，以未處理的菌株為對照，挑選正突變菌株。

1.2.4 菌株的復(fù)篩 菌株復(fù)篩的主要指標(biāo)是黃酮產(chǎn)量[7]，從正突變菌株中確定單因素誘變和復(fù)合誘變中的最佳突變菌株。

1.2.5 最優(yōu)菌株的遺傳穩(wěn)定性檢測 對復(fù)合誘變中的最佳正突變菌株進(jìn)行連續(xù)10次傳代培養(yǎng)，按照復(fù)篩方法檢測其菌絲干質(zhì)量和產(chǎn)黃酮能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 UV誘變

按照篩選正突變菌株常采用致死率為70%左右的誘變劑量這一規(guī)律，從表1可以看出，當(dāng)照射時間為75、90 s時，致死率分別為66%、71%，符合篩選條件。隨后對這個范圍內(nèi)的所有突變菌株進(jìn)行初篩，統(tǒng)計(jì)正突變率，確定UV誘變的最佳誘變時間。

表1 UV誘變不同照射時間的菌落數(shù)和致死率

由表2可以看出，誘變時間為90 s時，正突變率為28%，相對較高，所以選擇90 s為UV誘變的最佳照射時間。

表2 UV誘變較優(yōu)劑量范圍內(nèi)的正突變率

對較優(yōu)劑量范圍內(nèi)初篩獲得的10株正突變菌株進(jìn)行編號，再分別進(jìn)行復(fù)篩，測其黃酮產(chǎn)量，篩選UV誘變的最佳正突變菌株。

由表3可以看出，菌絲體生長最佳的為YZ-4，其菌絲體質(zhì)量為0.855 mg/mL，比對照菌株提高28.38%，其黃酮產(chǎn)量也提高12.59%，YZ-8菌絲體質(zhì)量為0.763 mg/mL，低于 YZ-4，但其黃酮產(chǎn)量提高37.04%，要明顯高于YZ-4的黃酮增長量，因此確定YZ-8為UV誘變的最佳正突變菌株，將菌株YZ-8保藏備用。

2.2 HNO2誘變

HNO2誘變不同處理時間的結(jié)果如表4所示。誘變時間為 20 min 時，致死率為62%；誘變時間為25 min時，致死率為78%，因此選擇這2個時間為較優(yōu)劑量，并進(jìn)一步確定最佳誘變時間。

表3 UV誘變產(chǎn)生的正突變菌株的黃酮產(chǎn)量

表4 HNO2誘變不同時間的菌落數(shù)和致死率

表5結(jié)果顯示，誘變時間為25 min時正突變率相對較高，為33%，因此選擇25 min為HNO2誘變的最佳反應(yīng)時間。

表5 HNO2誘變較優(yōu)劑量范圍內(nèi)的正突變率

復(fù)篩結(jié)果如表6所示，YY-4菌株黃酮產(chǎn)量最高，為 0.014 3 mg/mL，比對照菌株產(chǎn)量提高16.26%，菌絲體干質(zhì)量提高19.65%，確定YY-4菌株為HNO2誘變的最佳正突變株，保藏備用。

表6 HNO2誘變產(chǎn)生的正突變菌株的黃酮產(chǎn)量測定

2.3 復(fù)合誘變

2.3.1 UV-HNO2復(fù)合誘變 以UV誘變中的最佳突變菌株YZ-8為出發(fā)菌株，進(jìn)行HNO2誘變處理，對照組為UV誘變優(yōu)勢菌株YZ-8。由表7數(shù)據(jù)可知，隨著時間的延長，致死率逐漸增加，當(dāng)HNO2誘變時間為5 min時，開始出現(xiàn)菌株死亡；當(dāng)誘變時間達(dá)到25 min時，致死率達(dá)到100%。在這些處理時間中，誘變率有較大的變動幅度，當(dāng)誘變時間為15 min時，致死率為65%，當(dāng)誘變時間為20 min時，致死率為92%，而篩選時致死率最好在70～80%范圍內(nèi)，因此將15 min后的誘變時間間隔短一些，再進(jìn)行誘變處理，其結(jié)果如表8所示。

表7 UV-HNO2復(fù)合誘變的菌落數(shù)和致死率-1

由表8可知，當(dāng)誘變時間為17 min時，致死率為71%；19 min 時，致死率為83%，因此選擇這2個時間為較優(yōu)誘變時間，并進(jìn)一步確定最佳誘變時間。

表8 UV-HNO2復(fù)合誘變的菌落數(shù)和致死率-2

由表9可見，誘變時間為17 min時，正突變率相對較高，為27%，所以選擇17 min作為復(fù)合誘變中HNO2誘變的最佳反應(yīng)時間。隨后，對這6株正突變菌株編號，進(jìn)行復(fù)篩，測其黃酮產(chǎn)量，篩選HNO2誘變的最佳正突變油茶產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌菌株，結(jié)果如表10所示。Y-UH-2的黃酮產(chǎn)量最高，達(dá)到0.022 3 mg/mL，增幅均明顯高于其他菌株，是 UV-HNO2復(fù)合誘變的最佳正突變油茶產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌菌株。

表9 UV-HNO2復(fù)合誘變較優(yōu)劑量范圍內(nèi)的正突變率

表10 UV-HNO2誘變產(chǎn)生的正突變菌株的黃酮產(chǎn)量

2.3.2 HNO2-UV復(fù)合誘變 以HNO2誘變中的最佳突變菌株YY-4為出發(fā)菌株，對其進(jìn)行UV誘變處理，對照組為HNO2誘變優(yōu)勢菌株YY-4。

表11數(shù)據(jù)顯示，隨著時間的延長，致死率逐漸增加，當(dāng)UV誘變時間為15 s時，出現(xiàn)菌株死亡，當(dāng)誘變時間達(dá)到90 s時，致死率達(dá)到100%。在致死率數(shù)據(jù)中，當(dāng)致死率為77%時，誘變時間為45 s，當(dāng)致死率為87%時，誘變時間為 60 s。因此選擇45、60 s 2個時間作為較優(yōu)誘變時間，并進(jìn)一步確定最佳誘變時間。

表11 HNO2-UV復(fù)合誘變的菌落數(shù)和致死率

從表12可看出，誘變時間為45 s時，正突變率相對較高，為33%，所以選擇45 s為復(fù)合誘變中UV誘變的最佳反應(yīng)時間。

表12 HNO2-UV復(fù)合誘變較優(yōu)劑量范圍內(nèi)的正突變率

將較優(yōu)劑量范圍內(nèi)初篩獲得的5株正突變菌株進(jìn)行編號，再分別進(jìn)行復(fù)篩，測它們的黃酮產(chǎn)量，篩選HNO2誘變的最佳正突變菌株。

由表13可看出，Y-HU-3的黃酮產(chǎn)量最高，為 0.016 8 mg/mL，是HNO2-UV復(fù)合誘變的最佳正突變株。

表13 HNO2-UV誘變所產(chǎn)生的正突變菌株的黃酮產(chǎn)量測定

2.3.3 復(fù)合誘變高產(chǎn)菌株的比較 因?yàn)閺?fù)合誘變的出發(fā)菌株不同，其最佳正突變菌株的參比不同，因此須要選用同一對照，對2種復(fù)合誘變方法中的最佳正突變菌株的產(chǎn)黃酮能力進(jìn)行比較，以確定本研究中的最佳正突變菌株。此方法中選擇的參照為原始出發(fā)菌株JS-Ye6。

由表14可看出，Y-UH-2黃酮產(chǎn)率最高，產(chǎn)量為 0.022 4 mg/mL，比對照菌株產(chǎn)量提高53.4%，確定其為復(fù)合誘變的最佳正突變株。

2.3.4 最優(yōu)菌株的遺傳穩(wěn)定性 對Y-UH-2進(jìn)行10次連續(xù)傳代，雖然在連續(xù)傳代過程中，黃酮產(chǎn)量有所降低，但降低不太明顯，較為穩(wěn)定(表15)。

表14 不同復(fù)合誘變處理得到的最優(yōu)菌株的比較

表15 Y-UH-2連續(xù)傳代10次結(jié)果比較

3 結(jié)論與討論

利用微生物發(fā)酵法獲取目的產(chǎn)物是一種非常有前景的生產(chǎn)技術(shù)，微生物具有種群豐富、生長快、易培養(yǎng)、易控制、代謝產(chǎn)物豐富等特點(diǎn)，因此此法與單純的分離提取技術(shù)相比具有顯而易見的優(yōu)勢。但在微生物發(fā)酵法中使用的微生物通常并不是野生型菌株，野生型菌株并不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求，而生產(chǎn)菌株通常都是在野生型菌株的基礎(chǔ)上經(jīng)過一定的改造獲得的[8-9]。改造的方法很多，如點(diǎn)突變、構(gòu)建基因工程菌、誘變育種等，其中誘變育種是較為經(jīng)濟(jì)、使用率較高的一種方法[10]。誘變育種可分為單因素誘變法和復(fù)合誘變法。單因素誘變法就是整個誘變過程中只選用1種誘變劑去處理對象，而復(fù)合誘變是使用2種或2種以上誘變劑共同誘發(fā)同一對象的突變方式。

研究表明，復(fù)合誘變是尋找高活力突變菌株的較好方法，誘變效果通常比單因素誘變的效果好，王艷君等以產(chǎn)殼聚糖酶菌株為出發(fā)菌株進(jìn)行UV、亞硝酸鈉的單因素誘變及兩者的復(fù)合誘變[11]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)合誘變的效果要比單獨(dú)進(jìn)行UV誘變或亞硝酸鈉誘變的效果好，UV誘變得到的最佳優(yōu)勢菌株的活力為6.500 U/mL，亞硝酸鈉誘變得到的最佳優(yōu)勢菌株的活力為6.125 U/mL，復(fù)合誘變最佳優(yōu)勢菌株的活力為8.135 U/mL，相比之下復(fù)合誘變比UV誘變后的產(chǎn)殼聚糖酶菌株酶活力提高25.15%，比亞硝酸鈉誘變后的菌株酶活力提高32.82%[11]。楊春宇對丁醇耐受性菌株進(jìn)行研究，試驗(yàn)中原始菌株在3%濃度丁醇中的相對生長率為11.82%，分別采用微波、氯化鋰、微波-氯化鋰復(fù)合誘變的方法處理，在單因素誘變中，微波輻照和氯化鋰誘變效果較好，突變菌株的相對生長率分別提高至15.68%、15.35%，而復(fù)合誘變效果更佳，其中最佳優(yōu)勢菌株的生長率則提高至19.23%，近一步證明了復(fù)合誘變的效果優(yōu)于單因素誘變的效果[12]。高陽在產(chǎn)小檗堿內(nèi)生真菌的誘變育種試驗(yàn)中，以初始菌株S6為出發(fā)菌株；先進(jìn)行單因素誘變?nèi)鏤V誘變、激光誘變和亞硝酸鈉誘變，再進(jìn)行多種方式的復(fù)合誘變，主要是3種單因素誘變的組合，經(jīng)過誘變得到的最佳優(yōu)勢菌株產(chǎn)量分別為0.724、0.967、0.826、1.229、0.953、1.260 mg/L，相對于初始菌株產(chǎn)量(0.439 mg/L)增幅基本都超過50%，甚至有些超過100%，最終表明復(fù)合誘變的結(jié)果要優(yōu)于單因素誘變的效果[13]。

本試驗(yàn)結(jié)果也證明了復(fù)合誘變的效果一般要優(yōu)于單因素誘變的效果。在單因素誘變試驗(yàn)中，獲得的UV誘變的最佳突變菌株發(fā)酵液可產(chǎn)黃酮0.018 5 mg/mL，產(chǎn)量增幅為37.04%；獲得的HNO2誘變的最佳突變菌株發(fā)酵液可產(chǎn)黃酮 0.014 3 mg/mL，產(chǎn)量增幅為16.26%；復(fù)合誘變獲得的最佳突變菌株發(fā)酵液可產(chǎn)黃酮0.022 4 mg/mL，產(chǎn)量增幅為 53.4%，其產(chǎn)量均要高于UV單一誘變和HNO2單一誘變的結(jié)果。

復(fù)合誘變的效果優(yōu)于單因素誘變的效果，其原因可能是多種因子復(fù)合使用可以更為廣泛地作用于DNA，取長補(bǔ)短，造成DNA分子上多個基因位點(diǎn)的穩(wěn)定性發(fā)生改變，得到更多的突變類型，而單因素誘變作用范圍較窄，僅作用于DNA上的某一個區(qū)域，作用位點(diǎn)具有專一性，所以作用效果較差。但在具體試驗(yàn)中由于筆者對大多數(shù)微生物的遺傳背景并不清楚，選取的試驗(yàn)方法帶有一定的盲目性，所以復(fù)合誘變效果的好壞在一定程度上也取決于筆者所選擇的誘變劑種類。雖然在本研究中復(fù)合誘變的效果要好于單因素誘變，但也有可能運(yùn)用其他誘變劑的組合要優(yōu)于筆者所選用的UV-HNO2誘變法，因此在今后的研究中，筆者所在課題組須要嘗試更多的復(fù)合誘變方法，以期提高目的菌株的產(chǎn)量。

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