黃芪藥渣中多糖的酶法制備及其抗氧化活性

龍良鯤，寒子純，林群英，秦秀雯，趙浩源，丁少軍

(1.南京林業大學化學工程學院，江蘇南京 210037；2.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇南京 210042)

黃芪屬豆科植物，分為蒙古黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao]和膜莢黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.]，以干燥根入藥[1]。黃芪的主要藥用成分為黃芪多糖、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃酮等[2]。黃芪多糖(Astragaluspolysaccharides，APS)可作為免疫增強劑或調節劑，促進抗體形成，同時還有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗應激、抗氧化和降脂等功效[3-5]。工業上多采用水提醇沉法提取黃芪多糖，其工藝簡單易操作，但提取率較低(在3.80%～9.78%之間)[6-8]。黃芪經水提法制備多糖后形成的藥渣中仍含有多糖等活性物質，這些物質被纖維素等聚合物限制而不易溶出[9-10]。纖維素酶是可降解纖維素高聚物的一組酶系，在制備多糖等藥用活性物質方面具有良好的應用前景[8，11]。本試驗利用纖維素酶制備黃芪藥渣中的多糖，通過單因素和正交試驗優化酶解作用條件，并評價黃芪多糖的抗氧化活性，為進一步高效利用黃芪資源提供技術途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃芪，產地為甘肅省隴西縣，購自安徽省亳州市中藥材市場；里氏木霉(Trichodermareesei)D-86271，購自芬蘭VTT技術中心；秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans)，由筆者所在實驗室保存。百草枯，購自Sigma公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)等生化試劑均為國產分析純。

PDA培養基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，15 g瓊脂粉，加蒸餾水至1 000 mL。

Mandels培養基：2.0 g KH2PO4，1.4 g(NH4)2SO4，0.3 g Urea，0.3 g MgSO4·7H2O，1.0 mL微量元素濃縮液(3.7 g/L CoCl2·6H2O，1.4 g/L ZnSO4·7H2O，1.6 g/L MnSO4·H2O，5.0 g/L FeSO4·7H2O)，10.0 g葡萄糖，0.3 g 酵母膏，加蒸餾水至1 000 mL。

固體發酵培養基：1.5 g小麥麩，1.5 g脫木素麥稈，5.0 mL 10×Mandels培養基。具體配制方法參考文獻[12]。

1.2 試驗方法

1.2.1 固態發酵制備纖維素酶 參照文獻[12]中的方法進行固態發酵制備纖維素酶。取約108個里氏木霉孢子(PDA平板培養獲得)接種于100 mL Mandels培養基，并于28 ℃、200 r/min 振蕩培養2 d。將1 mL菌絲培養物接入固態發酵培養基中，混勻后30 ℃培養13 d。發酵結束后，每瓶發酵物中加入30 mL無菌水(含0.1%吐溫80)，置于25 ℃、120 r/min 條件下提取120 min。提取液經8 000 r/min、10 min 離心后取上清液。所得粗酶液加入終濃度為0.02%的三氮化鈉，并置于4 ℃保存備用。

1.2.2 酶活性的測定 參照文獻[12]中的方法分別測定發酵液中濾紙酶、內切型纖維素酶(CMC酶活)、β-葡萄糖苷酶及木聚糖酶的活性。酶活性測定均在50 mmol/L的檸檬酸緩沖液(pH值為4.8)中進行，各設3個重復。1個單位(U)濾紙酶、CMC酶或木聚糖酶分別定義為1 min催化相應底物生成1 μmol葡萄糖(濾紙酶和CMC酶)或木糖(木聚糖酶)的酶量；1個單位(U)的β-葡萄糖苷酶定義為1 min催化4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)生成1 μmol 4-硝基苯酚的酶量。

1.2.3 黃芪藥渣的獲得 黃芪經粉碎后，按固液質量比為 1 ∶10 加入蒸餾水，90 ℃、150 r/min水浴浸提2 h，5 000 r/min 離心10 min獲得上清液，重復提取1次。所得上清液加3倍體積的99%乙醇溶液，充分混勻，4 ℃靜置過夜，6 000 r/min、10 min離心，沉淀經60 ℃烘干，即得黃芪粗多糖。所得黃芪殘渣烘干至恒質量，裝袋密封備用。

1.2.4 酶法提取黃芪藥渣中的多糖

1.2.4.1 單因素試驗 稱取1 g黃芪藥渣裝入50 mL離心管中，加入5 mL 0.05 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH值為4.8)，分別加入不同量(0～10 U)的纖維素酶(以濾紙酶活性計算)，加入無菌水使總體積為10 mL。經50 ℃酶解2 h后，反應物經80 ℃水浴提取4 h，離心法獲得上清液并經醇沉法獲得粗多糖。粗多糖經適當稀釋后，以苯酚-硫酸比色法測定總糖含量，并以二硝基水楊酸(3，5-dinitrosalicylic acid，DNS)法測定寡糖含量，兩者之差即為多糖含量[13]。同時，比較不同酶解溫度(35～55 ℃)或酶解時間(1～8 h)對酶法制備黃芪多糖的影響。

1.2.4.2 正交優化試驗 根據單因素試驗結果，對纖維素酶用量、酶解時間和酶解溫度進行正交設計(表1)，優化黃芪多糖提取的最佳酶解條件。

表1 L16(43)正交試驗設計表

1.2.5 黃芪多糖的抗氧化活性

1.2.5.1 DPPH自由基清除測定 根據文獻[14]進行DPPH自由基清除測定，分別配制不同濃度(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40 mg/mL)的黃芪多糖。向10 mL玻璃試管中依次加入1 mL各濃度黃芪多糖待測液和2 mL 0.6 mg/L DPPH，混勻，室溫避光反應30 min，測定517 nm處的吸光度。以50%乙醇作為空白對照，每個處理重復3次，求平均值。DPPH清除率的計算公式如下：

SCDPPH=(1-DS517 nm/DC517 nm)×100%。

式中：SCDPPH為DPPH的清除率；DS517 nm為樣品的吸光度；DC517 nm為對照的吸光度。

1.2.5.2 線蟲抗氧化測定 通過添加百草枯誘導秀麗線蟲產生氧化應激損傷以評價黃芪多糖的抗氧化活性。將黃芪多糖制成一定濃度的溶液后，添加至培養有秀麗線蟲的96孔板中，于20 ℃培養48 h，再于每個孔里添加百草枯，使其終濃度為40 mmol/L。每24 h觀察1次線蟲存活情況并記錄線蟲存活數目，直至秀麗線蟲全部死亡，每組試驗所測秀麗線蟲數目不少于80條。

2 結果與分析

2.1 纖維素酶的制備及酶活性測定

由圖1可知，粗酶液中的濾紙酶、β-葡萄糖苷酶、CMC酶和木聚糖酶的活性分別為2.02、1.99、167.00、53.90 U/mL?？梢姡虘B發酵液中含有較高水平的纖維素酶和半纖維素酶。

2.2 酶法制備黃芪藥渣中多糖的影響因素

2.2.1 纖維素酶用量對黃芪多糖提取的影響 由圖2可知，未經纖維素酶水解作用，從黃芪藥渣中水提獲得的多糖提取量為2.9 mg/g；纖維素酶用量為0.2 U/g時，多糖提取量達8.2 mg/g。增加纖維素酶的用量，多糖的提取量明顯升高，纖維素酶用量為4.0 U/g時，多糖提取量達到最大值，為 34.7 mg/g。繼續增加纖維素酶的用量，黃芪多糖的提取量無明顯變化。因此，提取黃芪多糖的最佳纖維素酶用量為 4.0 U/g。酶解處理獲得的多糖量最高可達未經纖維素酶處理組的11.97倍。

2.2.2 酶解溫度對黃芪多糖提取的影響 酶解溫度對酶法制備黃芪多糖的效率有明顯的影響。由圖3可知，低溫(35 ℃)下，酶法提取黃芪多糖的提取量為27.9 mg/g。提高酶解溫度，黃芪多糖的提取量明顯增加，在45 ℃時，黃芪多糖的提取量達到最大值，為35.7 mg/g。繼續升高溫度，黃芪多糖的提取量明顯降低。因此，利用纖維素酶提取黃芪藥渣中黃芪多糖的最適溫度為45 ℃。

2.2.3 酶解時間對黃芪多糖提取的影響 由圖4可知，隨著酶解時間的延長，黃芪多糖的提取量明顯升高。酶解時間為4 h時，黃芪多糖的提取量達34.6 mg/g。進一步延長酶解時間，多糖提取量呈現下降的趨勢。因此，酶解4 h為最佳的酶解時間。

2.3 正交優化試驗

根據單因素試驗的結果，繼續對纖維素酶用量、酶解溫度、酶解時間這3個因素進行正交設計優化以獲得最佳的提取條件。正交試驗結果如表2所示，各因素對黃芪多糖提取量的影響程度表現為酶解溫度>纖維素酶用量>酶解時間。根據試驗結果優化得最佳提取條件為酶解溫度45 ℃、纖維素酶用量 4.0 U/g、 酶解時間4 h。最后經驗證，在此條件下黃芪多糖的提取量為44.6 mg/g。

表2 酶法提取黃芪多糖的正交試驗結果

2.4 黃芪多糖的抗氧化活性

由圖5可知，隨著黃芪多糖濃度的升高，其對DPPH自由基的清除率明顯提高，當黃芪多糖濃度達到0.30 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率可達25.4%。繼續升高黃芪多糖的濃度，其對DPPH自由基的清除率則無明顯增加。

由圖6可知，0.30 mg/mL黃芪多糖能夠明顯提高線蟲的存活率，最長存活時間為9 d，比空白對照組(CK)延長4 d。由圖7可知，添加0.30 mg/mL黃芪多糖，秀麗線蟲的平均壽命為3.48 d，比對照組(2.67 d)提高了30.3%。因此，黃芪多糖明顯降低了百草枯對線蟲引起的氧化損傷，其具有良好的抗氧化作用。

3 結論與討論

水提醇沉工藝只能獲取黃芪組織中部分多糖，殘留的藥渣中仍含有豐富的多糖等活性物質[9]，這部分物質由于受組織中纖維素等結構成分的限制而難以溶出。微生物等來源的纖維素酶能夠有效作用于黃芪組織中的纖維結構，從而促進黃芪多糖的提取[8，11，15]。相對于堿法(如氧化鈣水溶液)制備黃芪多糖，酶法制備具有條件溫和、產物純度高和綠色環保等優勢。本試驗以里氏木霉固態發酵獲得了高活性的纖維素酶，以經2次高溫水提處理的黃芪藥渣作為材料提取多糖。結果顯示，與未經酶處理的對照組相比，酶解處理使黃芪多糖的提取量提高了11.97倍。正交優化試驗結果表明，酶法制備多糖中的主要影響因素影響由大到小依次為酶解溫度、纖維素酶用量、酶解時間，而最佳酶解參數為酶解溫度45 ℃、纖維素酶用量 4.0 U/g、酶解時間 4 h，在此條件下，從黃芪藥渣中可獲得 44.6 mg/g 黃芪多糖。由此可見，纖維素酶對促進黃芪藥渣中多糖的制備具有重要的意義。同時，是否存在更加有效的黃芪組織水解酶系以進一步提高黃芪多糖的提取效率值得進一步研究。

抗氧化活性是黃芪多糖的重要生理功能[16]。本試驗體外抗氧化試驗結果表明，酶法制備的黃芪多糖對DPPH自由基的清除率為25.4%，低于文獻報道值[14，17]。這可能與獲得的黃芪多糖分子量或結構有一定的關系[18]。同時，以秀麗線蟲為模型測試黃芪多糖的體內抗氧化能力，發現0.30 mg/mL黃芪多糖明顯增強了秀麗線蟲對百草枯的抗性，處理組線蟲的平均壽命延長了30.3%。結果表明，纖維素酶法制備的黃芪多糖具有結構完整性，顯示出良好的抗氧化活性。利用纖維素酶技術促進黃芪藥渣中多糖的制備，對實現黃芪資源的高效利用具有重要意義。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010.

[2]張 薔，高文遠，滿淑麗.黃芪中有效成分藥理活性的研究進展[J].中國中藥雜志，2012，37(21)：3203-3207.

[3]Auyeung K K，Han Q B，Ko J K.Astragalusmembranaceus：a review of its protection against inflammation and gastrointestinal cancers[J].The American Journal of Chinese Medicine，2016，44(1)：1-22.

[4]Sun Q R，Jia N，Wang W X，et al.Protective effects of astragaloside Ⅳ against amyloid beta1-42 neurotoxicity by inhibiting the mitochondrial permeability transition pore opening[J].PLoS One，2014，9(6)：e98866.

[5]姜琛璐，湯 承，騫 宇，等.黃芪多糖免疫調節作用研究進展[J].食品科學，2013，34(11)：327-332.

[6]賀義恒，張紅夏，趙 曄，等.恒山黃芪中黃芪多糖提取工藝研究[J].中國中醫藥信息雜志，2013，20(3)：52-54.

[7]金芬芬，金錫姣，楊惠鑫，等.不同提取方法對黃芪多糖提取率影響的實驗研究[J].中華中醫藥學刊，2013，31(10)：2136-2138.

[8]董玲玲，黃 鑫，齊陽光，等.酶解-微波法提取黃芪多糖的工藝研究[J].浙江工業大學學報，2011，39(5)：528-531.

[9]趙海燕，馬永平，劉雅靜.利用醇提藥渣提取黃芪多糖的工藝研究[J].安徽農業科學，2008，36(36)：15977-15978，15980.

[10]陸 潭，張李陽，陳玉勝.一種黃芪藥渣發酵產物的抗高尿酸血癥活性[J].江蘇農業科學，2013，41(9)：288-291.

[11]鄭立穎，魏彥明，陳 龍.纖維素酶在黃芪有效成分提取中的應用[J].甘肅農業大學學報，2005，40(1)：94-96.

[12]Long L，Ding D，Han Z，et al.Thermotolerant hemicellulolytic and cellulolytic enzymes fromEupenicilliumparvum 4-14 display high efficiency upon release of ferulic acid from wheat bran[J].Journal of Applied Microbiology，2016，121(2)：422-434.

[13]閆巧娟，韓魯佳，江正強.纖維素酶法提取黃芪多糖[J].中草藥，2005，36(12)：1804-1807.

[14]吳 銘，韓 丹，郭立泉.黃芪多糖的提取與抗氧化活性檢測[J].湖北農業科學，2015，54(17)：4263-4265.

[15]王文文，李小丹，黃齊磊，等.纖維素酶協同高壓熱水提取香菇多糖的研究[J].中國食品添加劑，2015(4)：106-110.

[16]李寶霞，董雙濤，霍乃蕊.黃芪多糖抗氧化活性研究[J].山西中醫學院學報，2011，12(5)：16-18.

[17]李金芳.黃芪多糖的提取及抗氧化作用研究[J].中國食品添加劑，2015(4)：143-147.

[18]李紅法，郭松波，滿淑麗，等.乙醇分級沉淀提取黃芪多糖及其理化性質和抗氧化活性研究[J].中國中藥雜志，2015，40(11)：2112-2116.