陜西佛坪木蹄層孔菌的揮發性成分及生物活性

解修超，羅 強，路宏朝，陳文強，鄧百萬

(1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中 723001；2.陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西漢中 723001)

木蹄層孔菌(Fomesfomentarius)別稱火絨層孔菌，為擔子菌門(Basidiomycete)傘菌綱(Agaricomycetes)多孔菌目(Polyporales)多孔菌科(Polyaceae)層孔菌屬(Fomes)真菌，是世界性分布的木腐性真菌。在18、19世紀，曾被用來作為止血的膏藥，在傳統的藥典中被用來與針灸搭配治療疾??；其藥用部位為子實體，粗提物具有抗腫瘤、抗氧化、利尿、退燒、消積化、消炎止痛等作用，已經被應用于傳統藥物的生產。

近年來，陸勇芹等研究發現，木蹄層孔菌乙醇提取物對腫瘤細胞具有很強的抑制作用[1-2]。研究表明，不同提取方法所獲得的提取物組分具有部分差異，其中報道過的化學成分包括有機酸、多糖、內酯、苷類、植物甾醇和萜類化合物等[3]。劉量等用乙醇提取木蹄層孔菌子實體所得的提取物對S180腹腔積液瘤、人肺癌細胞NCI-H 460和人胃癌細胞SGC-7901均有較明顯的抑制效果[2，4]。陸勇芹等用石油醚等提取木蹄層孔菌所得的提取物對Hela、H22荷瘤、人肺癌(NCI-H 460)和胃腺癌(SGC-7901)等細胞株均具有較強的抑制效果[1，3，5]。高慧靈等研究木蹄層孔菌中多糖對小鼠免疫功能的影響，結果表明，木蹄多糖可促進小鼠免疫細胞分泌細胞因子，增強小鼠的體液免疫功能及巨噬細胞的吞噬功能[6-7]。

本研究以陜西佛坪木蹄層孔菌為材料，通過索氏提取及氣相色譜-質譜聯用(gas chromatography-mass spectrometer，簡稱GC-MS)技術，分析子實體中揮發性物質的化學成分，并對揮發性物質的抑菌和抗腫瘤活性進行研究，以期為陜西佛坪木蹄層孔菌資源的開發與利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 木蹄層孔菌 木蹄層孔菌子實體樣品(圖1)采自陜西佛坪自然保護區，該自然保護區位于秦嶺中段南坡(33°43′40″N，107°46′05″E)。

1.1.2 靶標菌株和腫瘤細胞株 大腸埃希菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)由陜西省食藥用菌工程技術研究中心提供；肺癌腫瘤細胞株A549，由陜西理工大學維生素D生理與應用研究所提供。

1.1.3 儀器與試劑 氣相色譜-質譜聯用儀(GS6890N/MSD5973N型，美國安捷倫科技有限公司)，高級研究顯微鏡(E600型，日本Nikon公司)，二氧化碳培養箱(Thermo3110型，美國Thermo公司)，酶標分析儀(TECAN infinite 200 PRO型，瑞士TECAN公司)，倒置生物顯微鏡[徠卡DMIL/DFC450，德國徠卡(Leica)公司]，數顯式恒溫培養箱(LRH-250-GS 型，廣東省醫療器械廠)；所用抗生素(青霉素和氯霉素)購自美國MP Biomedicals公司，分析純試劑(乙醚，二甲基亞砜等)購自天津市科密歐化學試劑有限公司，培養基所需試劑購自陜西西安熱默爾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 揮發性成分提取 將木蹄層孔菌子實體置于40 ℃烘箱中恒溫干燥48 h，干燥至恒質量，粉碎過40目篩備用。稱取樣品40.0 g，用濾紙包裹后置于索氏提取器中，加入 300 mL 乙醚，加熱至40 ℃恒溫，回流提取 8 h，相同溫度回收乙醚，得揮發油樣品。

1.2.2 GC-MS檢測 采用氫氧化鉀-甲醇酯化法對樣品進行處理，得到GC-MS檢測用樣[3，8]。GC-MS的檢測條件：美國J & W HP-5彈性石英毛細管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)，程序升溫(以5 ℃/min的速率由50 ℃升至 240 ℃，恒溫保持2 min，進樣口溫度200 ℃)，GC氣化室溫度為 250 ℃，載氣為99.99%高純度氦氣，流速為2.0 mL/min。質譜條件：離子源為電子電離源(electron ionization，簡稱EI)，電子轟擊能量70 eV，離子源溫度230 ℃。倍增電壓 1.28 kV，質量掃描范圍為m/z10～550，掃描速度3.8次/s[9-10]。檢測結果在美國NIST11.lib 標準質譜圖庫檢索確認其成分，得到總離子流圖，運用峰面積歸一化法并借助G170LBA化學工作站數據處理系統處理數據。

1.2.3 生物活性檢測

1.2.3.1 抑菌活性檢測 采用濾紙片擴散法[10]測定樣品對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的抑制作用。取適量揮發性物質原液，分別配制成質量濃度為200.0、100.0、50.0 g/L的樣品溶液，分別加入適量過氧化氫酶消除可能帶來的活性影響。將直徑為6.0 mm的無菌濾紙片置于各濃度樣品上清液中浸濕，貼在涂有30.0 μL靶標菌懸液(菌懸液密度為0.8×106～1.2×106CFU/mL)的LB培養基平板上，對照組分別為無菌水、1%苯扎溴銨溶液、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，簡稱DMSO)、青霉素和氯霉素，37 ℃ 恒溫培養24 h后，觀察并采用十字交叉測量法記錄抑菌圈直徑，測量各質量濃度樣品在不同靶標菌平板上的抑菌圈直徑。處理平行組、對照組分別設5個重復。

1.2.3.2 抗腫瘤活性檢測 采用CCK-8法[11]測定樣品的抗腫瘤活性。取對數期肺癌腫瘤細胞株A549，經過血球計數板計數后使細胞液密度達到5×104個/mL，然后接入96孔板中，每孔接100 μL (腫瘤細胞數約5 000個/孔)，取相應質量組分揮發油樣品用濾頭過濾除菌，分別溶于適量二甲基亞砜中(最終DMSO的質量分數<1%)[12]，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基充分稀釋溶解藥物，作為試驗組樣品。37 ℃培養24 h使細胞貼壁，試驗組每孔各加入含相應質量濃度揮發性物質的培養液200.0 μL，5孔重復，樣品揮發油設5個倍比質量濃度梯度，分別為32.0、64.0、128.0、256.0、512.0 mg/L，以含1% DMSO的等量培養基作空白對照，其他操作步驟均與試驗組相同。37℃繼續培養，分別在培養24、48 h時置于顯微鏡下觀察肺癌腫瘤細胞株A549的生長情況。48 h 后向每孔中加入CCK-8試劑10.0 μL，繼續同溫培養1～8 h，用酶標分析儀檢測加入CCK-8試劑后1、2、4、8 h各孔在 450 nm 處的吸光度。按以下公式計算各濃度揮發油對腫瘤細胞株A549的抑制率：腫瘤細胞生長抑制率=(1-試驗組D450 nm/空白對照組D450 nm)×100%。

采用SPSS 19.0軟件進行曲線擬合，最終得半數抑制率所需揮發油質量濃度IC50。

2 結果與分析

2.1 揮發性成分的提取

取樣品40.00 g，以乙醚作為溶劑，采用索氏提取法回流提取12 h，得到具有特殊香味的紅褐色透明狀揮發油 2.33 g，經計算得率為5.83%。

2.2 揮發性成分的化學組成與分析

對木蹄層孔菌的揮發性成分進行GC-MS檢測，得樣品中揮發性成分的相對含量，結果如表1所示。由表1可知，經多重比對共檢測出7種主要化學成分，占總揮發性成分的99.99%，主要成分為酞酸二乙酯(37.82%)、十八烷醛(32.83%)、壬醛(11.98%)、9(11)-脫氫麥角酰苯甲酸酯(9.87%)，此4種成分占總檢測揮發油成分的92.50%。

表1 木蹄層孔菌揮發性成分的化學組成與含量

2.3 木蹄層孔菌揮發性成分的生物活性

2.3.1 抑菌活性 以4種細菌作為靶標菌，對揮發性成分進行抑菌活性研究。試驗結果(表2)表明，各質量濃度揮發油表現出不同程度的抑菌活性。由表2可知，木蹄層孔菌揮發油對4種靶標細菌抑制活性均較弱，不同質量濃度的抑菌效果具有一定劑量-效應依賴關系。其中揮發油質量濃度為200.0 g/L時，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達10.27 mm，對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌表現較弱的抑制活性。

2.3.2 抗腫瘤活性 將加入相應質量濃度揮發油的腫瘤細胞置于37 ℃、含5% CO2的培養箱中培養，分別在培養24、48 h 時觀察腫瘤細胞的生長狀況，結果如圖2至圖5所示。由圖2至圖5可知，試驗組在培養24 h后，腫瘤細胞數量與同期空白對照相比明顯減少，形態相對皺縮，部分細胞裂解；48 h時相對數量繼續減少，大部分細胞出現裂解現象；空白對照組中的腫瘤細胞在48 h內數量持續增加，形態近橢圓狀，貼壁生長，易聚集成群。經顯微觀察，試驗組與對照組的5孔平行重復同一時期未見明顯差異。

表2 木蹄層孔菌揮發性成分對4種靶標菌的抑菌情況

注：表中數據為5個平行組的平均數值；濾紙片直徑為 6.00 mm；0為未產生抑菌圈；1 000單位/mg青霉素用無菌水稀釋，1 000 單位/mg氯霉素用DMSO稀釋，濃度均為25.0 mg/mL。

通過CCK-8法測定不同濃度揮發油對肺癌腫瘤細胞株A549的抗腫瘤活性，在 450 nm處測量樣品的吸光度。試驗結果(圖6)表明，提取物對肺癌腫瘤細胞株A549的抑制率與樣品濃度之間呈劑量-效應依賴關系，對照組加入CCK-8試劑4 h后的吸光度為2.683。

由圖6可知，木蹄層孔菌揮發性成分可明顯抑制肺癌腫瘤細胞株A549的生長，并且隨著樣品濃度升高，對肺癌腫瘤細胞株A549的抑制效應升高，抑制率最高達76.73%。其中隨著添加量倍比的增高，抑制效應的相應強度明顯上升，較高濃度時抑制率的增長逐漸變緩。由揮發油濃度與肺癌腫瘤細胞株A549抑制率之間的量效關系生成的對數擬合曲線計算得到IC50=268.675 mg/L。

3 討論

本研究利用GC-MS技術分析并檢測陜西佛坪木蹄層孔菌中7種揮發性成分，結果顯示，主要為酯類和醛類，并且7種有效成分的總含量占總揮發性成分的99.99%，其中含量超過2.00%的化學成分有5種，占全部鑒定成分的96.50%，且大部分揮發性成分在其他研究中尚見未報道，如杜德堯等用石油醚、乙醇、甲醇和三氯甲烷等提取試劑時[3，5]，均未獲得本研究所檢測到的部分有效成分，并且酞酸二乙酯、壬醛、9(11)-脫氫麥角酰苯甲酸酯在木蹄層孔菌成分分析中屬首次獲得。筆者分析這可能與木蹄層孔菌寄生樹種、生長條件和提取試劑等有關。

筆者對陜西佛坪木蹄層孔菌的揮發性成分進行抑菌及抗腫瘤活性研究。試驗結果表明，揮發油樣品對供試4種靶標菌中的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌抑制活性較弱，對金黃色葡萄球菌抑菌效果較強。在抗腫瘤活性檢測中，樣品對肺癌腫瘤細胞株A549顯示較高的抗腫瘤活性。經細胞形態跟蹤觀察發現，48 h內揮發油對腫瘤細胞生長的抑制作用表現穩定并持續增加；另外，隨著樣品濃度的倍比增加，腫瘤細胞的抑制率與樣品濃度之間呈劑量-效應依賴關系，IC50為 268.675 mg/L。 本研究采用 CCK-8 法進行細胞增殖檢驗，避免使用準確度不高、易出現假陽性和步驟繁瑣等缺點的MTT法，同時，萬文婷等報道CCK-8法檢驗細胞增殖效果較MTT法更佳[13]。因此，排除了部分假陽性的干擾，使研究結果更加準確可靠。木蹄層孔菌的揮發性成分主要為酯類和醛類等，有較好的抗腫瘤活性和一定的抑菌活性，可為陜西佛坪木蹄層孔菌資源的開發與綜合利用提供一定的理論指導，而關于本研究揮發油中的抑菌有效成分、最低拮抗濃度及抑菌機制還有待進一步探究。

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