寡糖誘導桔梗抗根腐病的研究

李堆淑

(商洛學院生物醫藥與食品工程學院，陜西商洛 726000)

桔梗[Platycodongrandiflorus(Jacp.)A.DC.]為桔梗科(Campanulaceae)多年生草本植物，在我國主要分布于東北、華北、華中、華南等地區。其根可入藥，是我國傳統的中藥材，具有較高的食用價值[1]。近年來，由于大片種植桔梗，管理粗放，桔梗的根腐病、枯萎病、根結線蟲病、紫紋羽病、斑枯病、白粉病等病害越來越嚴重，直接影響了桔梗的生長發育，還影響了桔梗入藥的品質和質量。桔梗根腐病發病比較頻繁，根腐病是由半知菌類鐮刀菌引起的根部病害，是一種土傳病害，土壤濕度大或作物連作易發病，比較難防治。利用誘抗劑誘導植物產生抗性來防治病害，在許多植物上均有較好的防治效果[2]。植物的誘導抗病性作為一種后天免疫功能可以降低植物的受害程度[3]。局部抗性伴隨著植保素的積累、細胞壁的加強[4]，而系統抗性的獲得以病程相關蛋白作為重要生化標記。寡糖(oligosaccharide)是經酸水解、堿水解或酶水解而制得2～10個單糖分子組成的低聚合度水溶性的糖類。寡糖可以促進植物生長和發育，誘導激活植物體內合成抗性相關酶及增加基因表達量，促使植保素合成、木質素積累，提高植物的抗病能力[5]。因此，本研究用腐皮鐮刀菌酸水解的寡糖誘導已感病的桔梗苗，研究桔梗抗根腐病(腐皮鐮刀菌)的能力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

桔梗苗高20 cm左右，盆栽；腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)，由商洛學院生物與食品工程學院微生物實驗室分離并保存。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，18 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水。

馬鈴薯葡萄糖(PD)培養基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，1 000 mL 蒸餾水。

1.2 試驗方法

1.2.1 寡糖的制備 先將腐皮鐮刀菌在PDA培養基上培養3 d，然后將直徑為5 mm的菌餅接入PDA培養基的三角瓶中，放在搖床(25 ℃、130 r/min)上培養5 d。分成2份，一份將菌絲體用蒸餾水洗3次，低溫烘干、粉碎過100目篩，稱取10 g菌絲粉，用1.0 mol/L HCl酸解1 h，調節pH值為7；再加入90%乙醇，進行分級沉淀，4 000 r/min離心15 min得到淺棕色的多糖粉末；配制成濃度分別為0、5、10、15、20 μg/mL的寡糖溶液，備用。另一份配成109CFU/mL孢子懸浮液，備用。

1.2.2 桔梗苗的處理 將桔梗苗浸泡于腐皮鐮刀菌的孢子懸浮液(109CFU/mL)3 d后，水培養桔梗苗10 d，再用不同濃度的寡糖溶液對桔梗苗的葉面進行噴施(噴至溶液不流為止)，以噴施蒸餾水作為對照(CK)，每組設3個重復，每天噴1次，連續處理3 d后分為2份，一份從第3天開始每天采樣1次，到第8天，測定其生理生化指標；另一份分別在第0、第3、第6、第8天觀察并統計桔梗苗根腐病的病情指數和防治效果，每次調查15株。

1.2.3 病情調查 病情分級標準：0級為桔梗苗根部未發病，1級為病斑面積占根部總面積的5%及以下，3級為病斑面積占根部總面積的6%～10%，5級為病斑面積占根部總面積的11%～25%，7級為病斑面積占根部總面積的26%～50%，9級為病斑面積占根部總面積的51%及以上(葉片枯萎或葉柄折斷)[6]。

病情指數=100×∑(各級病根數×各級代表值)/(調查總根數×最高級代表值)；

防治效果=(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數×100%。

1.2.4 桔梗生理生化指標測定 過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創木酚法，測定470 nm處的吸光度，以1 min吸光度的變化值表示酶活力[7]。過氧化氫酶(CAT)活性的測定采用高錳酸鉀滴定法[8]。超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用四氮唑藍光還原法，測定560 nm處的吸光度[9]。丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸比色法，分別測定600、532、450 nm處的吸光度[10]。

2 結果與分析

2.1 桔梗苗的病情指數調查

由表1可知，不同濃度的寡糖溶液對桔梗苗抗根腐病的誘導效果不同。在同一時間，隨著寡糖溶液濃度的增大，桔梗苗根腐病的病情指數不斷減小，當寡糖溶液的濃度增加到 10 μg/mL 時，桔梗苗根腐病的病情指數最小，再增大寡糖溶液的濃度，桔梗苗根腐病的病情指數逐漸增大。隨著寡糖溶液誘導桔梗苗時間的延長，只有10 μg/mL寡糖溶液誘導的防治效果一直增大，其余處理濃度誘導的防治效果均是先增大后減小。隨著誘導時間的延長，CK處理的桔梗苗根腐病的病情指數逐漸升高，且高于寡糖溶液處理的病情指數。當寡糖溶液濃度為10 μg/mL時，防治桔梗苗根腐病的效果最好，且在第8天桔梗苗根腐病的防治效果為36.36%，分別比5、15、20 μg/mL寡糖溶液誘導的防治效果高217.83%、61.24%、525.82%。

表1 桔梗苗根腐病的病情指數及防治效果

2.2 寡糖溶液對桔梗苗葉片生理特征的影響

2.2.1 寡糖溶液對桔梗苗葉片SOD活性的影響 由圖1可知，經不同濃度的寡糖溶液誘導處理3 d桔梗苗，桔梗苗葉片SOD活性均有所變化。在第3天至第8天用不同濃度的寡糖溶液和CK誘導處理桔梗苗葉片，其SOD活性均先升高后降低，桔梗苗葉片的SOD活性表現為10 μg/mL寡糖溶液 >15 μg/mL寡糖溶液>5 μg/mL寡糖溶液>20 μg/mL寡糖溶液>CK，且均在第7天達到最大值。用10 μg/mL寡糖溶液誘導處理的桔梗苗葉片的SOD活性最大值分別比15、5、20 μg/mL 寡糖溶液及CK誘導處理的桔梗苗葉片SOD活性最大值高14.21%、16.35%、19.63%、27.92%。可見，10 μg/mL 寡糖溶液誘導桔梗苗抗根腐病的能力最佳，且明顯高于其他濃度寡糖溶液的誘導效果，表明低濃度的寡糖溶液更能有效誘導桔梗苗提高葉片的SOD活性，增強桔梗苗的抗病能力。

2.2.2 寡糖溶液對桔梗苗葉片POD活性的影響 POD作為生物體一種重要的氧化還原酶，能促進殺菌效果及木質素和木栓質的合成，從而殺滅病原菌或阻止病原物質入侵，POD活性與抗病性密切相關[11]。由圖2可知，桔梗苗經不同濃度的寡糖溶液誘導處理后，桔梗苗葉片POD活性呈先升高后降低的變化趨勢，其中，CK處理的桔梗苗葉片POD活性總是明顯低于寡糖溶液誘導處理的桔梗苗葉片的POD活性。5、15、20 μg/mL寡糖溶液誘導處理的桔梗苗葉片POD活性的升降幅度均較穩定，10 μg/mL寡糖溶液誘導處理的桔梗苗葉片POD活性的升降幅度較大。10 μg/mL寡糖溶液在誘導處理第5天時，桔梗苗葉片的POD活性達到峰值，且明顯高于其他處理的桔梗苗葉片POD活性的峰值。5、10 μg/mL寡糖溶液誘導處理的桔梗苗葉片POD活性的峰值均出現在第5天，CK和15 μg/mL寡糖溶液誘導處理的桔梗苗葉片POD活性的峰值出現在誘導處理的第6天，20 μg/mL寡糖溶液誘導處理的桔梗苗葉片POD活性的峰值出現在誘導處理的第7天，要增強桔梗葉片抗根腐病的能力，必須通過提高POD的活性才能抵抗病害帶來的影響。可見，10 μg/mL寡糖溶液誘導處理的桔梗葉片POD活性最大，表明一定濃度的寡糖對桔梗抗根腐病的誘導有一定的效果。

2.2.3 寡糖溶液對桔梗苗葉片CAT活性的影響 CAT作為一種誘導酶，可以催化木質素的形成，促進細胞壁木質化來抵抗病原菌的侵染[11]。由圖3可知，經不同濃度的寡糖溶液誘導處理的桔梗葉片CAT活性均發生了變化。CK處理的桔梗苗葉片CAT活性一直降低，5、10、15、20 μg/mL寡糖溶液誘導處理的桔梗苗葉片CAT活性均先升高后降低，在誘導處理第5天時，桔梗苗葉片CAT活性均達到峰值，10 μg/mL寡糖溶液誘導處理從第4天至第8天桔梗苗葉片的CAT活性明顯高于其他3種濃度處理的桔梗苗葉片的CAT活性。5、10、15 μg/mL 寡糖溶液誘導處理的桔梗苗葉片CAT活性較明顯，20 μg/mL寡糖溶液誘導處理的桔梗苗葉片CAT活性的變化較平緩。10 μg/mL 寡糖溶液誘導處理的桔梗苗葉片CAT活性的峰值分別比CK、5、15、20 μg/mL寡糖溶液誘導處理的桔梗苗葉片CAT活性的峰值高153.20%、20.12%、22.44%、137.08%。可見，一定濃度的寡糖溶液誘導處理桔梗苗，其葉片的CAT活性增強，可抵御病原菌的侵害，且 10 μg/mL 寡糖溶液誘導處理的效果最明顯，說明10 μg/mL寡糖溶液誘導桔梗苗抗根腐病的效果最佳。

2.2.4 寡糖溶液對桔梗苗葉片MDA含量的影響 由圖4可知，用不同濃度的寡糖溶液誘導處理桔梗苗，其葉片MDA的含量均有不同程度的變化。在第3天至第8天，CK處理的桔梗葉片MDA含量一直上升，說明隨著時間的延長腐皮鐮刀菌不斷地入侵桔梗細胞。用不同濃度的寡糖溶液誘導處理桔梗苗，其葉片的MDA含量變化趨勢總體上是先下降后上升，5、10 μg/mL寡糖溶液誘導處理的桔梗苗，其葉片MDA含量變化較明顯，均在誘導處理的第6天達到最低值，且在整個誘導過程中10 μg/mL寡糖溶液處理的桔梗葉片MDA含量比其他處理的桔梗苗葉片MDA含量低。可見，一定濃度的寡糖溶液能夠有效降低桔梗苗葉片中MDA的含量，從而降低了對植物膜質的傷害程度。表明10 μg/mL寡糖溶液誘導桔梗苗抗根腐病有較好的效果。

2.3 寡糖溶液對桔梗苗葉片各生理指標相關性的影響

由表2可知，經不同濃度的寡糖溶液誘導處理已感根腐病的桔梗苗，從第3天至第8天桔梗苗葉片的POD、CAT、SOD活性與MDA的含量均兩兩相關。POD活性與CAT、SOD活性在0.001水平上顯著正相關，CAT活性與MAD含量在0.001水平上顯著負相關，CAT活性與SOD活性在0.05水平上顯著正相關，MDA含量與POD、SOD活性在0.01水平上顯著負相關。

表2 桔梗苗葉片各生理指標的相關性

注：“*”“**”“***”分別表示在0.05、0.01、0.001水平上顯著相關。

3 結論與討論

植物可以改變細胞代謝和激發不同的防御機制來調節外界的各種脅迫。利用植物誘導劑可以誘導水稻、煙草、蔬菜等植物的抗病性[12-14]。寡糖作為植物誘導劑，具有環保、安全、穩定等特點，寡糖可以參與植物的抗病、抗逆反應，它能夠快速誘導脂質過氧化并激活抗病基因的表達，降低脂質過氧化物水平，減輕植物的傷害。

本研究用不同濃度的寡糖溶液誘導處理已經感染根腐病3 d的桔梗苗，在同一時間，隨著寡糖溶液濃度的增加，桔梗苗根腐病的病情指數不斷減小，當寡糖溶液的濃度增加到 10 μg/mL 時，桔梗苗根腐病的病情指數最小，再增加寡糖溶液的濃度，桔梗苗根腐病的病情指數逐漸增大。隨著處理時間的延長，經10 μg/mL寡糖溶液誘導的防治效果一直增大，其他濃度的寡糖溶液處理，桔梗苗根腐病的防治效果先增大后減小。經10 μg/mL寡糖溶液誘導的桔梗苗的防治效果最好，且在第8天桔梗苗根腐病的防治效果為36.36%。不同濃度的寡糖溶液誘導桔梗苗葉片，與CK相比，均能提高桔梗苗葉片SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性，降低桔梗苗葉片細胞內MDA的含量，且10 μg/mL寡糖溶液誘導的效果最佳。桔梗苗葉片的POD、CAT、SOD活性均兩兩呈顯著正相關，MAD含量分別與POD、CAT、SOD活性呈顯著負相關。譚姣姣等的研究表明，0.5% 南極菌β-3胞外寡聚糖能夠顯著降低黃瓜白粉病的病情指數，防治效果達24.49%，能提高黃瓜幼苗POD的活性[15]。用不同濃度的堆肥菌液誘導處理的桔梗幼苗，其SOD活性、POD活性、葉綠素含量與CK相比均有明顯的升高，而MDA含量則有明顯的下降趨勢[16]。孫翠紅等的研究表明，殼寡糖對煙草花葉病毒的抑制率為66.39%，還可以提高煙草葉片中SOD、POD、CAT、PAL的活性[17]。本研究的結果與這3個研究的結果基本一致。

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