奶牛隱性乳房炎大腸桿菌16S rRNA序列分析

謝 昆，蔣成硯，劉 杰，李橋善，周文樹，唐秀華，汪 鏡

(1.紅河學院生命科學與技術學院，云南蒙自 661199；2.云南省高校農作物優質高效栽培與安全控制重點實驗室，云南蒙自 661199)

奶牛乳房炎是奶牛高發病之一，極大地影響了奶牛業發展[1]，根據臨床表現可分為臨床型、非臨床型2種。其中，非臨床乳房炎即隱性乳房炎，最主要是奶牛隱性乳房炎[2]，導致奶牛隱性乳房炎的病原菌主要有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌等，其中大腸桿菌較為重要[3]。目前，奶牛乳房炎的治療主要靠抗生素，但是經過時間積累，大量使用或者濫用抗生素現象較為突出，導致抗生素大量殘留在奶牛體內，最終導致其產生耐藥菌株[4]。因此，盡早診斷出導致奶牛隱性乳房炎的病原菌，對人類健康和經濟發展至關重要[5]。奶牛隱性乳房炎不僅給奶牛養殖業帶來了巨大經濟損失，而且牛奶也因為奶牛患病而使其營養價值下降，甚至當人類食用帶有病原菌的牛奶后會給人類健康帶來巨大威脅[6-7]。本研究在生理生化初步鑒定的基礎上，提取病原菌DNA，設計特異性引物，通過分子生物學方法檢測奶樣中大腸桿菌16S rRNA，并與GenBank中發表的16S rRNA序列進行比較，以便建立一種檢測奶樣中大腸桿菌的分子生物學方法。

1 材料與方法

1.1 材料

經過生理生化鑒定的大腸桿菌為筆者所在實驗室從奶樣中分離保存。

1.2 細菌培養

在超凈工作臺中，將經過生化鑒定并進行純化培養后初步確定的大腸桿菌接種到LB培養液中，再將培養液放置在37 ℃、150 r/min的搖床中培養24 h后提取細菌DNA。

1.3 細菌DNA提取

應用CTAB結合SDS法提取大腸桿菌DNA，取5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA含量。

1.4 大腸桿菌16S rRNA的PCR擴增

根據GenBank上發表的大腸桿菌16S rRNA序列(NC002695)，應用Primier premier 5 引物設計軟件設計1對特異性引物，引物序列如下：P1，5′-GAATCACAAAGT GGTAAGCGC-3′；P2，5′-TCGAACAATAACAGGAAACAGC-3′，以提取的細菌DNA為模板進行PCR擴增，反應條件如下：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，49.7 ℃退火1 min，72 ℃延伸100 s，28個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，取5 μL樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 PCR產物的測序和分析

將PCR擴增產物送到深圳華大基因科技服務有限公司，完成正反測序，序列結果運用DNAStar軟件進行同源性分析。

2 結果與分析

2.1 細菌DNA的提取

細菌DNA經CTAB結合SDS法提取后于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明，細菌DNA約為21 000 bp(圖1)。

2.2 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳

PCR產物經1%瓊脂糖電泳檢測，結果見圖2，從圖2可以看出，PCR產物約為1 400 bp，與預測結果一致。

2.3 序列同源性對比

PCR產物經測序后，將測序結果與GenBank中大腸桿菌16S rRNA基因序列(NC002695)進行同源性對比分析，發現二者序列相似性為96%，同源性對比結果見圖3。

3 討論與結論

細菌基因組DNA提取方法較多，有SDS法、CTAB法[8]、傳統DNA抽提法、加熱煮沸發、試劑盒抽提法、chelex 100法。 本研究利用SDS、CTAB混合法提取細菌基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測可看到細菌DNA提取過程中無污染，瓊脂糖凝膠條帶中無拖尾現象，說明細菌提取的基因組DNA較為完整。

16S rRNA基因是細菌染色體上編碼rRNA相對應的DNA序列，存在于所有細菌的染色體基因組中，具有較高的保守性，由于16S rRNA基因核苷酸序列總長度適宜，結構完整，更便于對細菌進行各種研究。因此設計一對引物，以 16S rRNA 為靶分子在適當條件下進行PCR擴增，便得到擴增后的16S rRNA片段，將擴增后的16S rRNA基因序列與基因庫中的片段比對，便可以知道未知菌與其他菌的同源性，從而完成對菌的鑒定。

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[4]閆常平.奶牛隱性乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗[D].哈爾濱：東北農業大學，2003.

[5]高會玲.雙抗體夾心ELISA檢測奶牛隱性乳房炎的研究[D].長春：吉林農業大學，2007.

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[8]周 彪，郭政宏，嚴亨秀.藏豬糞便芽孢桿菌基因組DNA的提取方法[J].江蘇農業科學，2016，44(4)：93-95.