杜仲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

林向前

（福建省漳州市中醫(yī)院，福建 漳州 363000）

杜仲片是我院骨傷科經(jīng)典傳統(tǒng)中藥制劑，可補(bǔ)腎強(qiáng)腰、活血化瘀，適用于急慢性腰部損傷、關(guān)節(jié)酸痛等腎虛血瘀證，50多年的臨床應(yīng)用證明，該藥療效確切且未見(jiàn)不良反應(yīng)[1]。為控制其質(zhì)量，筆者參考文獻(xiàn)[2]，建立了杜仲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent 1260型高效液相色譜儀，包括Agilent－G1311C型四元泵，Agilent G1329B型真空脫氣器，Agilent－G1315D型二極管陣列檢測(cè)器，Chemstation B．04．02型化學(xué)工作站[3]（美國(guó)安捷倫公司）；KQ－250B 型超聲清洗機(jī)（昆山超聲儀器有限公司）；Mettler Toledo EL2401型電子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）。

試藥：芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)為 110736－201136，含量以96．0%計(jì)，使用前無(wú)需處理），當(dāng)歸對(duì)照藥材（批號(hào)為 927－200110），丹皮酚對(duì)照品（批號(hào)為 0708－9704），延胡索乙素對(duì)照品（批號(hào)為0726－200208），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；杜仲片（批號(hào)分別為20150701，20150901，20151101），杜仲片缺味陰性對(duì)照品，均由本院制劑中心提供；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 一般質(zhì)量控制

性狀：本品為褐黑色片；氣微辛，味微苦。

檢查：按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0101片劑項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定，對(duì)3批樣品重量差異、崩解時(shí)限、微生物限度進(jìn)行檢查，結(jié)果均符合規(guī)定[4]。

2．2 定性鑒別

當(dāng)歸：取杜仲片20片，搗碎成細(xì)粉，加乙醚40 mL，超聲處理5 min，靜置2 h，濾過(guò)，濾液蒸發(fā)干燥，干燥物加入乙酸乙酯1 mL，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙猓鳛楣┰嚻啡芤骸Ａ砣‘?dāng)歸對(duì)照藥材1 g，按上述方法制備對(duì)照藥材溶液[5]。同法制備缺當(dāng)歸的陰性對(duì)照品溶液。按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502薄層色譜法[4]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各6 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）－乙酸乙酯（50∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視[6]。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾（圖1 A）。

牡丹皮：取當(dāng)歸鑒別項(xiàng)下的供試品溶液，作為供試品溶液。另取丹皮酚對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。同法制備缺牡丹皮飲片的陰性對(duì)照品溶液[5]。照2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502薄層色譜法[4]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各8 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯－冰醋酸（10 ∶1 ∶0．1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視[6]。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾（圖1 B）。

延胡索：取杜仲片30片，搗碎成細(xì)粉，加甲醇50 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸發(fā)干燥，干燥物加水15 mL攪拌使其溶解，用氨水調(diào)pH至9～10，用乙醚提取2次，每次15 mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL充分?jǐn)嚢枋谷芙猓鳛楣┰嚻啡芤篬5]。另取延胡索乙素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。同法制備缺醋延胡索飲片的陰性對(duì)照品溶液。照2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502薄層色譜法[4]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各8 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上，以正己烷 － 氯仿 － 甲醇（7．5∶4∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置碘蒸氣熏至斑點(diǎn)顯色清晰，在空氣中揮盡板上吸附的碘后，置紫外光燈（365 nm）下檢視[6]。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾（圖1 C）。

圖1 杜仲片薄層色譜圖

2．3 芍藥苷含量測(cè)定

2．3．1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Lichrospher－C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 － 0．1% 磷酸溶液（13 ∶87）；流速：1．0 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：30 ℃ ；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，芍藥苷達(dá)到基線分離（芍藥苷色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度大于1．50）[7]，理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)應(yīng)不低于2 000，詳見(jiàn)圖2。

2．3．2 溶液制備

取杜仲片10片，搗碎成細(xì)粉，稱取約0．5 g，精密稱定，放入帶有瓶塞的錐形瓶中，加入70%甲醇50 mL，蓋緊瓶塞，準(zhǔn)確稱定總質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用上述溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液[8－9]。同法制得缺赤芍、牡丹皮的陰性對(duì)照品溶液。取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成含芍藥苷0．12 g／L的溶液，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2．3．3 方法學(xué)考察[2]

專屬性試驗(yàn)：按2．3．1項(xiàng)下色譜條件，分別精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖（圖2）。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同位置上有相同時(shí)間保留峰，而陰性對(duì)照無(wú)干擾。芍藥苷保留時(shí)間約為20．8 min，測(cè)得理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)為14 506。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取對(duì)照品溶液（117．408μg／mL）1，2，4，6，8，10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)、芍藥苷進(jìn)樣量（μg，X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y ＝ 1 242．638 8 X －7．596 3，r＝0．999 8(n＝6)。結(jié)果表明，芍藥苷進(jìn)樣量在 0．117 408 ～ 1．174 080 μg 范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液（117．408μg／mL）5 μL，重復(fù)進(jìn)樣 6次。結(jié)果峰面積積分值的 RSD為0．19%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20150701）供試品6份，依法制備供試品溶液（定容至50 mL具塞錐形瓶中），按擬訂色譜條件進(jìn)樣，以芍藥苷峰面積積分值計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表1，可見(jiàn)，方法重復(fù)性良好。

圖2 杜仲片高效液相色譜圖

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，注入液相色譜儀，分別于 0，2，4，8，12，16 h 時(shí)依法測(cè)定峰面積[10]。結(jié)果分別為 838．239 38，839．581 48，837．495 97，839．503 11，840．758 06，840．421 88，RSD 為 0．15% （n ＝6），表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量（批號(hào)為20150701，含量為 6．48 mg ／g）的樣品 0．25 g，置 25 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入芍藥苷對(duì)照品適量，按擬訂方法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

2．3．4 樣品含量測(cè)定

精密稱取3批杜仲片，按擬訂方法制備供試品溶液，依法測(cè)定芍藥苷含量。結(jié)果批號(hào)為 20150701，20150901，20151101的3批樣品中芍藥苷含量分別為6．48，6．37，6．57 mg ／g，平均含量為 6．473 mg ／g。

表2 芍藥苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

3 討論

3．1 定性指標(biāo)選擇

杜仲為杜仲片的君藥，松脂醇二葡萄糖苷為杜仲的主要有效成分，參考2015年版《中國(guó)藥典（一部）》的方法，色譜柱采用 Lichrospher－C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈 － 0．1% 磷酸溶液（13 ∶87），檢測(cè)波長(zhǎng)為 227 nm，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為30℃，對(duì)杜仲片中的松脂醇二葡萄糖苷進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液在與松脂醇二葡萄糖苷相同保留時(shí)間處均未檢出色譜峰，說(shuō)明樣品中含量甚微，這可能與鹽杜仲的加熱炮制及杜仲片的生產(chǎn)工藝有關(guān)，故暫不建立杜仲片中松脂醇二葡萄糖苷的含量測(cè)定方法。

3．2 提取溶劑選擇

取杜仲片10片，搗碎成細(xì)粉，稱取約0．5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入稀乙醇、70%甲醇、甲醇各50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用上述溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。結(jié)果用稀乙醇、70%甲醇、甲醇提取得芍藥苷含量分別為 4．02，6．57，5．16 mg ／g。可見(jiàn)，采用 70% 甲醇作為提取溶劑，樣品中芍藥苷的含量明顯較高。

3．3 赤芍薄層鑒別

由于處方中赤芍飲片具有散瘀止痛的功效，故本研究中曾嘗試進(jìn)行赤芍的薄層鑒別，分別采用多種提取方法(①正丁醇直接提取；②正丁醇直接提取后用氨試液洗滌；③正丁醇直接提取后用氨試液洗滌，取正丁醇層再用水洗滌等)，并進(jìn)行比較，最后選用背景干擾較少的方法③進(jìn)行提取，陰性對(duì)照品溶液的制備方法同③。對(duì)提取液采用2種展開(kāi)系統(tǒng)[氯仿－甲醇－醋酸乙酯（8∶3∶1）氨飽和 20 min，以及氯仿 －醋酸乙酯 －甲醇 －甲酸（40 ∶5 ∶10 ∶0．2）]進(jìn)行展開(kāi)鑒別，發(fā)現(xiàn)缺赤芍的陰性對(duì)照品溶液均有干擾，故不對(duì)此進(jìn)行鑒別。

3．4 顯微鑒別

試驗(yàn)中還曾嘗試進(jìn)行杜仲的顯微鑒別，但由于投料加工后受其他藥材染色的影響，色較暗，與投料用的鹽杜仲在特征上雖有一定差異，但很難觀察。此外，杜仲藥材所具有的石細(xì)胞顯微特征，在制劑中并不具唯一性。因此，不對(duì)杜仲進(jìn)行顯微鑒別。

[1]林向前 ．杜仲片提取工藝研究[J]．中國(guó)藥業(yè)，2013，22（13）：32－33．

[2]邵紅燕，張和明，劉志海．骨質(zhì)增生貼質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]．中國(guó)藥房，2010，21（27）：2563 － 2564．

[3]王麗聰，李 松．苦參配方顆粒質(zhì)量控制研究[J]．現(xiàn)代藥物與臨床，2012，27（5）：471 － 473．

[4]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典（四部）[M]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：3 －4，57－59．

[5]楊 艷，郝麗曉，李利芬，等．對(duì)中藥材市場(chǎng)丹參質(zhì)量的考察[J]．科技情報(bào)開(kāi)發(fā)與經(jīng)濟(jì)，2004，14（2）：125 － 126．

[6]夏 荃．祛斑膠囊質(zhì)量控制方法的研究[J]．陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，29（2）：64 － 65．

[7]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：105．

[8]楊 培，李 建，徐 蓓，等．黔產(chǎn)山銀花栽培品種的鑒定與含量測(cè)定[J]．中國(guó)藥業(yè)，2007，16（16）：20 － 21．

[9]劉會(huì)前，李成網(wǎng)．十四味連黃燒傷軟膏的制備與質(zhì)量控制[J]．中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29（16）：1401 － 1403．

[10]李 虹．腎石通顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J]．中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2010，11（3）：176 － 179．