反相高效液相色譜法測(cè)定酚氨咖敏片的含量及其均勻度

王麗瓊

（四川省樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 樂(lè)山 614000）

酚氨咖敏片主要適用于感冒、發(fā)熱、頭痛、神經(jīng)痛及風(fēng)濕痛等，其為復(fù)方制劑，主要成分為氨基比林、對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因和馬來(lái)酸氯苯那敏，價(jià)格便宜，文獻(xiàn)報(bào)道的不良反應(yīng)有肝損害[1]、白細(xì)胞減少[2]、嚴(yán)重皮疹[3]等，還存在主要成分對(duì)乙酰氨基酚的安全性問(wèn)題[4]。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[5]中采用高效液相色譜（HPLC）法分別測(cè)定上述4種成分的含量，氯苯那敏出峰時(shí)間約為23 min，對(duì)乙酰氨基酚峰和咖啡因峰分離度差，且操作煩瑣，耗時(shí)長(zhǎng)。有人采用HPLC法同時(shí)測(cè)定酚氨咖敏顆粒中上述4種成分的含量[6]，以及酚氨咖敏片中咖啡因與馬來(lái)酸氯苯那敏的含量均勻度[7]，但均僅洗脫出馬來(lái)酸峰，未洗脫出氯苯那敏峰。還有人采用HPLC法測(cè)定酚氨咖敏片中氨基比林、對(duì)乙酰氨基酚和咖啡因的溶出度[8－9]，以及馬來(lái)酸氯苯那敏含量均勻度[10]，采用氣相色譜（GC）法同時(shí)測(cè)定酚氨咖敏片中4種成分的含量[11]，采用近紅外漫反射光譜法測(cè)定酚咖片中對(duì)乙酰氨基酚和咖啡因的含量[12]。但尚未見(jiàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定酚氨咖敏片4種主要成分含量及其均勻度的報(bào)道。本研究中采用常用的C18柱和簡(jiǎn)單的二元流動(dòng)相，以梯度洗脫提高分離性能，建立了能同時(shí)測(cè)定酚氨咖敏片4種組分含量的質(zhì)量控制方法，同時(shí)對(duì)咖啡因和馬來(lái)酸氯苯那敏的含量均勻度進(jìn)行了考察。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，含二極管陣列檢測(cè)器和OpenLAB CDS色譜工作站（美國(guó)Agilent公司）；XS205 DualRange型電子天平，SevenMulti型酸度計(jì)（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1．2 試藥

氨基比林對(duì)照品（批號(hào)為100503－201302，純度為99．9%），對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品（批號(hào)為 100018－201409，純度按 99．9% 計(jì)），咖啡因?qū)φ掌罚ㄅ?hào)為171215－201010，純度按 100．0%計(jì)），馬來(lái)酸氯苯那敏對(duì)照品（批號(hào)為 100047－201507，純度按 99．7%計(jì)）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；酚氨咖敏片（云南白藥集團(tuán)大理藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為DLA1586，DHA1628，DMA1610）；甲醇為色譜純，磷酸二氫鉀、三乙胺、磷酸、糊精、羧甲淀粉鈉、二氧化硅和硬脂酸鎂均為分析純，馬鈴薯淀粉為生物試劑，試驗(yàn)用水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：Waters XTerra? RP18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A 為甲醇，B 為 0．02 mol／L 磷酸二氫鉀溶液 － 三乙胺（100 ∶0．02），梯度洗脫（0～15 min，A 相20%→75%；15～16 min，A 相 75%→20%；16～21 min，A 相 20%）；流速：1．0 mL ／min；柱溫：30 ℃ ；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2．2 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取氨基比林對(duì)照品100．36 mg，對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品 150．00 mg，咖啡因?qū)φ掌?29．98 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用25%甲醇（用10%磷酸調(diào)節(jié)pH至3．5）溶解；精密稱取馬來(lái)酸氯苯那敏對(duì)照品10．84 mg，精密稱定，置 25 mL容量瓶中，用25%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5mL，置上述50mL容量瓶中，用25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液。精密量取25 mL，置100 mL容量瓶中，用25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取樣品20片，稱定，計(jì)算平均單片質(zhì)量，稱取適量（約相當(dāng)于對(duì)乙酰氨基酚150 mg），置200 mL容量瓶中，用25%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

溶劑空白溶液：25%甲醇（用10%磷酸調(diào)節(jié)pH至3．5)。

陰性對(duì)照品溶液：按處方比例取空白輔料，同供試品溶液配制方法制備，即得。

圖1 高效液相色譜圖

2．3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：分別取2．2項(xiàng)下3種溶液及溶劑空白溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)圖1。在擬訂色譜條件下，4個(gè)組分可完全分離。理論板數(shù)按對(duì)乙酰氨基酚峰計(jì)算為13 345；馬來(lái)酸峰與對(duì)乙酰氨基酚峰的分離度為16．11，對(duì)乙酰氨基酚峰與咖啡因峰的分離度為5．52，咖啡因峰與氨基比林峰的分離度為14．63，氨基比林峰與氯苯那敏峰的分離度為13．44。結(jié)果表明，在擬訂色譜條件下，4個(gè)測(cè)定組分（5個(gè)峰）分離好，溶劑和輔料在對(duì)照品溶液4組分（5個(gè)峰）相應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)色譜峰，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

定量限確定：稱取各組分對(duì)照品適量，精密穩(wěn)定，加25%甲醇溶解并稀釋制成氨基比林、對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因和馬來(lái)酸氯苯那敏質(zhì)量濃度分別為 0．25，0．37，0．15，1．08 μg／mL 的溶液，按 2．1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果見(jiàn)表1。

線性關(guān)系考察：精密量取對(duì)照品貯備液 0．5，1．0，2．0，3．0，4．0，5．0 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，加 25%甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取各溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以各組分峰面積（A）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（C，μg／mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表1。

精密度試驗(yàn)：精密量取對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果見(jiàn)表1，可見(jiàn)儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取批號(hào)為DMA1610的酚氨咖敏片樣品，依法制備6份供試品溶液，精密量取各溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以樣品中4組分標(biāo)示量的百分含量計(jì)算。見(jiàn)表1。可見(jiàn)，方法重復(fù)性符合要求。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取氨基比林、對(duì)乙酰氨基酚和咖啡因的對(duì)照品及片劑中的其他組分，按處方量的100%，分別置6個(gè)200 mL容量瓶中，加適量25%甲醇溶解；精密稱取馬來(lái)酸氯苯那敏對(duì)照品20 mg，置50 mL容量瓶中，用25%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，分別置上述相應(yīng)的200 mL容量瓶中，用25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得每個(gè)組分6份供試品溶液。精密量取以上6種溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算加收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取批號(hào)為DMA1610的樣品，依法制備供試品溶液，室溫放置，分別于 0，2，4，6，8，12，24，36，48 h精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積。結(jié)果見(jiàn)表1，可見(jiàn)明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

耐用性試驗(yàn)[13]：取對(duì)照品溶液，分別采用不同柱溫（29．0，29．5，30．0，30．5，31．0 ℃ ）和不同流速（0．990，0．995，1．000，1．005，1．010 mL ／min），其他條件同 2．1項(xiàng)，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積。結(jié)果見(jiàn)表1，可見(jiàn)在測(cè)定條件有微小變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響，系統(tǒng)耐用性好。

表1 方法學(xué)考察試驗(yàn)結(jié)果

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（%，n＝3）

2．4 樣品含量測(cè)定

取批號(hào)為DLA1586，DHA1628，DMA1610的酚氨咖敏片各3份，依法制備供試品溶液。精密量取各溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

2．5 樣品含量均勻度測(cè)定

取批號(hào)為DLA1586，DHA1628，DMA1610的酚氨咖敏片各1片，分別置200 mL容量瓶中，加適量25%甲醇，超聲助溶，放冷，用25%甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取各溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，進(jìn)樣10次，記錄色譜圖。按外標(biāo)法測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品含量，并根據(jù)2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》（通則 0941）[14]計(jì)算含量均勻度（A ＋2．2 S），結(jié)果均符合要求。詳見(jiàn)表4。

表4 樣品含量均勻度測(cè)定結(jié)果(n＝10)

3 討論

3．1 色譜條件考察

波長(zhǎng)選擇：根據(jù)4種成分的紫外光譜圖（200～400 nm）進(jìn)行分析[15]。馬來(lái)酸氯苯那敏在215 nm波長(zhǎng)處的吸收度約為其特征波長(zhǎng)261 nm處的3倍，氨基比林和咖啡因的吸收度和其特征波長(zhǎng)相近，對(duì)乙酰氨基酚的吸收度最小，而對(duì)乙酰氨基酚的處方量最大，馬來(lái)酸氯苯那敏的處方量最小。綜合考慮，選擇215 nm波長(zhǎng)較合適。

流動(dòng)相選擇：試驗(yàn)中比較了流動(dòng)相B分別為0．02 moL ／L 磷酸二氫鉀溶液或 0．02 moL ／L 磷酸二氫鉀溶液 －三乙胺（100∶0．02）對(duì)色譜峰的影響。結(jié)果顯示，無(wú)三乙胺時(shí)氨基比林峰的對(duì)稱性差，選用后者為流動(dòng)相。同時(shí)比較了梯度洗脫與等度洗脫對(duì)分離效能的影響。4種組分（5個(gè)峰）理化性質(zhì)不一致，當(dāng)采用甲醇－0．02 mol／L 磷酸二氫鉀溶液 － 三乙胺（20 ∶80）為流動(dòng)相等度洗脫時(shí)，氯苯那敏不出峰，氨基比林出峰時(shí)間約為19 min，且峰展寬，采用梯度洗脫提高甲醇比例，有利于氯苯那敏和氨基比林峰的分離。經(jīng)過(guò)考察，在此梯度洗脫程序下，4組分（5個(gè)峰）在13 min內(nèi)全部洗脫出來(lái)，各峰間分離度好，氨基比林峰窄而尖。

3．2 樣品溶劑選擇

本研究中比較了95%乙醇、無(wú)水乙醇、25%甲醇、25%甲醇（分別用 10% 磷酸調(diào) pH 至 3．5，2．5，1．5）6 種溶劑對(duì)各組分提取效果的影響。結(jié)果采用95%乙醇和無(wú)水乙醇提取的樣品溶液色譜圖中對(duì)乙酰氨基酚峰和咖啡因峰有肩峰，且峰展寬；采用25%甲醇（用10%磷酸調(diào)pH至2．5和1．5）提取的樣品溶液色譜圖中氨基比林峰形差，峰展寬，拖尾；25%甲醇對(duì)氯苯那敏的提取率低。經(jīng)過(guò)考察，最后選用25%甲醇（用10%磷酸調(diào)pH至 3．5）為溶劑。

3．3 應(yīng)用價(jià)值

現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)采用HPLC等度洗脫法分2次測(cè)定酚氨咖敏片中4組分的含量。本研究方法優(yōu)勢(shì)在于：一是采用HPLC法同時(shí)測(cè)定了酚氨咖敏片4組分含量，考察了咖啡因和馬來(lái)酸氯苯那敏的含量均勻度，操作簡(jiǎn)便，氯苯那敏出峰時(shí)間約縮短一半；二是色譜圖中，對(duì)乙酰氨基酚峰和咖啡因峰分離度升高2倍多，分離效能大幅提高；三是檢測(cè)波長(zhǎng)處馬來(lái)酸氯苯那敏紫外吸收強(qiáng)度提高了3倍，檢測(cè)靈敏度明顯升高。可見(jiàn)，本方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適用于酚氨咖敏片的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

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