高效液相色譜法同時測定解郁安神顆粒中甘草苷及甘草酸含量*

樊寶娟，黃 艷，羅定強，吳 芳，楊亞麗，戴 涌

（陜西省食品藥品監督檢驗研究院，陜西 西安 710065）

解郁安神顆粒由甘草、柴胡、大棗、石菖蒲、半夏、白術、浮小麥、遠志、梔子、百合、膽南星、郁金、龍齒、酸棗仁、茯苓、當歸16味中藥材經提取加工而成，有疏肝解郁、安神定志功效，用于情志不暢、肝郁氣滯所致失眠、心煩、焦慮、健忘，神經官能癥、更年期綜合征見上述證候者。方中甘草具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥功效[1]。甘草的主要成分為三萜類與黃酮類成分，甘草苷及甘草酸則是這兩類化合物中重要的單體活性成分[2－3]。甘草酸有抗炎、抗病毒等作用，甘草苷有抗抑郁、神經保護、肝臟毒性保護等作用[4－7]。為有效控制該藥品的質量及確保藥效，節約檢驗成本，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法在同一色譜系統中測定解郁安神顆粒中甘草酸及甘草苷的含量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

LC－20AD 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Sartorius BS224S型電子天平，AE－240型電子分析天平（賽多利斯公司）；KQ－500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；恒溫水浴箱（北京化玻聯醫療器械有限公司）。

1．2 試藥

甘草酸對照品（批號為 110731－201418）、甘草苷對照品（批號為111610－201106）均購自中國食品藥品檢定研究院；192批解郁安神顆粒樣品均為2016國家評價性抽驗抽樣所得，分別為14個生產企業的不同批次；甘草陰性對照及解郁安神顆粒自提樣品為陜西省食品藥品檢驗所中藥室采用自購藥材按處方工藝提取所得；乙腈（美國天地公司）為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate XD－C18柱（250mm×4．6mm，5 μm）；流動相[8－10]：乙腈（A） －0．05% 磷酸溶液（B），梯度洗脫（見表1）；檢測波長：237 nm；流速：1．0 mL ／min；柱溫：35℃。

表1 流動相梯度洗脫表

2．2 溶液制備

供試品溶液[11－15]：取樣品適量，研細，稱取 1 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

對照品溶液：取甘草苷對照品、甘草酸對照品適量，精密稱定，加70%乙醇分別制成每1 mL含甘草苷15 μg及甘草酸25 μg的溶液，即得。

陰性對照品溶液：取按處方和工藝制備的不含甘草的陰性樣品1 g，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。

2．3 方法學考察

專屬性考察：分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各10 μL，進樣，記錄色譜圖。陰性對照品溶液色譜中，在與甘草苷、甘草酸對照品保留時間處無色譜峰，說明陰性對照無干擾，色譜圖見圖1。

線性關系考察：精密吸取質量濃度為13．68 μg／mL的甘草苷及質量濃度為23．48 μg／mL的甘草酸對照品溶液 1，2，5，10，15，25 μL，分別注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標、質量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸。結果甘草苷回歸方程為 Y＝1 831．1 X＋20901，r＝0．9992(n＝6)，線性范圍為 13．68～342．00μg；甘草酸回歸方程為 Y＝290．0 X＋2 386．0，r＝0．996 8(n ＝6)，線性范圍為 23．48 ～ 587．00 μg。

精密度試驗：精密吸取甘草苷質量濃度為13．68μg／mL及甘草酸質量濃度為 23．48 μg／mL的混合對照品溶液，重復進樣6次，每次10 μL，按擬訂色譜條件測定峰面積。結果甘草苷、甘草酸峰面積的 RSD分別為0．36%和 1．18% （n＝ 6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：分別于 0，5，10，15，20，25 h 時對供試品溶液進行測定。結果甘草苷、甘草酸峰面積的 RSD分別為 1．19% ，0．90%（n ＝6）。表明甘草苷及甘草酸在供試品溶液中25 h內穩定。

重復性試驗：取同一批樣品混合均勻，按上述方法制備6份供試品溶液，分別依法進樣測定。結果甘草苷、甘草酸含量的 RSD分別為 1．16%和 1．01%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：分別精密量取已知含量的樣品（甘草酸含量為 1．00 mg ／g，甘草苷含量為 0．12 mg ／g）6 份，各 0．5 g，分別加入質量濃度為 0．521 g／L的甘草酸對照品溶液1 mL及質量濃度為0．034 g／L的甘草苷對照品溶液1 mL，同法制備供試品溶液，測定。結果見表2。

圖1 專屬性考察高效液相色譜圖

2．4 樣品含量測定

采用擬訂方法測定樣品，結果表明，不同批次、不同企業間的各個組分含量差異明顯。樣品總批次為192批，不合格 148批，不合格率為 77．08%，詳見表3。可見，8家企業不合格率大于95．00%，其余企業也均存在不同程度的不合格現象。提示企業在甘草投料中應制訂定量指標，加大把關力度，確保投料的準確性。

表2 加樣回收試驗結果（n＝6）

表3 樣品判定結果統計表

3 討論

根據解郁安神顆粒的處方量及工藝，解郁安神顆粒中每袋理論含有甘草0．3 g，參照2015年版《中國藥典（一部）》甘草項下甘草酸及甘草苷含量規定，考慮水提取工藝，暫定樣品每袋含甘草苷（C21H22O9）不得少于0．45 mg，甘草酸（C42H62O16）不得少于 1．80 mg。

本研究中分別考察了甲醇、乙醇、70%甲醇為提取溶劑，結果以70%甲醇為溶劑時，提取最完全。另對檢測波長、柱溫、流動相等條件均進行了探索，結果顯示，流動相為乙腈 －0．05% 磷酸溶液梯度洗脫，峰形和分離效果最佳，在237 nm波長處目標物響應值最大，且無干擾，柱溫在30，35，40℃時無明顯差異，故暫定柱溫為35℃。

綜上所述，采用本研究中新建立的方法，可快速測定解郁安神顆粒中甘草苷及甘草酸的含量，該方法精確度、效率及成本控制等方面也均有優勢，為更好地控制該制劑質量奠定了基礎，也可為控制甘草藥材的治療量提供參考。

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