“血紅蛋白的提取與分離”實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)

朱昊

摘要 以大學(xué)實(shí)驗(yàn)室為平臺(tái)，以實(shí)驗(yàn)操作順序?yàn)橹骶€(xiàn)，以問(wèn)題串為引領(lǐng)，采用“先講解原理后實(shí)踐提升”的教學(xué)策略，突破了教學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了教師行為和學(xué)生行為的有效對(duì)接，有效達(dá)成了教學(xué)目標(biāo)。

關(guān)鍵詞 血紅蛋白 分離 色譜法 電泳

中圖分類(lèi)號(hào) G633.91

文獻(xiàn)標(biāo)志碼 B

文件編號(hào)：1003-7586（2018）11-0049-03

1實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分析

“血紅蛋白的提取和分離”是人教版選修1專(zhuān)題5“DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)”中課題3的內(nèi)容。該實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖箤W(xué)生能夠體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過(guò)程和方法。該實(shí)驗(yàn)涉及的分子生物學(xué)技術(shù)較多，如凝膠色譜法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、透析等。大部分學(xué)生對(duì)該實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)原理不易理解，操作難度大，但是理科生對(duì)這部分內(nèi)容卻充滿(mǎn)興趣。由于大多數(shù)學(xué)校缺乏相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，都采取“講實(shí)驗(yàn)代替做實(shí)驗(yàn)”的方式。而新課標(biāo)理念注重學(xué)生的實(shí)踐過(guò)程，為了培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神，筆者借助大學(xué)實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)，解決了中學(xué)無(wú)法開(kāi)展此課題的難題。

2實(shí)驗(yàn)教學(xué)目標(biāo)

說(shuō)出從血液中初步獲取血紅蛋白的原理和方法;說(shuō)明凝膠色譜法的原理和方法;說(shuō)出SDS-PAGE電泳的基本原理和方法;進(jìn)行樣品的預(yù)處理;運(yùn)用凝膠色譜法對(duì)血紅蛋白進(jìn)行分離純化;運(yùn)用SDS-PAGE電泳對(duì)血紅蛋白進(jìn)行純度鑒定。

嘗試提取和分離血液中的血紅蛋白，體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過(guò)程和方法;通過(guò)了解有關(guān)蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域的新進(jìn)展，以血紅蛋白為實(shí)驗(yàn)材料，學(xué)習(xí)提取和分離蛋白質(zhì)的基本技術(shù)，激發(fā)學(xué)生興趣，培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)際操作能力。

真切體會(huì)到真實(shí)的科學(xué)探究實(shí)踐活動(dòng)，初步形成科學(xué)的思維方式。

3實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容

第一課時(shí)安排：講解血液的基本成分、實(shí)驗(yàn)選材問(wèn)題以及如何從血液中提取和分離血紅蛋白的實(shí)驗(yàn)思路等基礎(chǔ)知識(shí)。組織學(xué)生對(duì)血液樣品進(jìn)行處理（紅細(xì)胞的洗滌、血紅蛋白的釋放、分離血紅蛋白溶液、透析等實(shí)驗(yàn)操作步驟）。課后，組織部分學(xué)生配制電泳相關(guān)溶液及試劑、組裝電泳裝置、制膠等。

第二課時(shí)安排：講解凝膠色譜法的原理以及運(yùn)用凝膠色譜法對(duì)血紅蛋白進(jìn)行純化。

第三課時(shí)安排：講解SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳原理以及通過(guò)電泳法對(duì)提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行純度鑒定。

4教學(xué)設(shè)計(jì)思路

5教學(xué)過(guò)程

5.1課前的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)材料：課前教師去屠宰場(chǎng)采集牛血，放在4℃冰箱過(guò)夜，以備第二天用。

實(shí)驗(yàn)器材：磁力攪拌器、冰箱、電子天平、燒杯、量筒、吸管、離心管、離心機(jī)、漏斗、KDM型調(diào)溫電熱套、透析袋、超聲波清洗器、恒溫水浴鍋、錐形瓶、蛋白質(zhì)電泳槽、梳子、商品化凝膠色譜柱、Bio-Rad蛋白純化系統(tǒng)、注射器、eppendorf管、各量程的移液槍?zhuān)?000uL、200uL、10uL）、脫色搖床、電泳儀電源、培養(yǎng)皿、恒溫金屬浴。

實(shí)驗(yàn)試劑及藥品：新鮮牛血、檸檬酸鈉、甲苯、生理鹽水、20nmol/L磷酸緩沖液、Sephadexg-75凝膠、考馬斯亮藍(lán)R250染液、脫色液、1M Tris-HCL PH6.8緩沖液、1.5M Tris-HCL PH8.8緩沖液、30% Acr-Bis（29：1）、10% SDS、10%過(guò)硫酸銨、TEMED、蛋白質(zhì)Marker、蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液、5X蛋白質(zhì)電泳緩沖液。

5.2第一課時(shí)：樣品的處理和粗分離

5.2.1創(chuàng)設(shè)情境，導(dǎo)入新課

教師出示資料：血紅蛋白是人體紅細(xì)胞的主要蛋白質(zhì)，由血紅素和蛋白質(zhì)組成。珠蛋白肽鏈結(jié)構(gòu)異常和某些肽鏈合成不足常導(dǎo)致血紅蛋白疾病，前者稱(chēng)異常血紅蛋白病，后者為地中海貧血。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，電泳分析是研究和分離異常血紅蛋白的有效方法，是診斷血紅蛋白分子病不可缺少的手段。如何檢測(cè)新生兒是否患有血紅蛋白疾病呢？通過(guò)本節(jié)課的學(xué)習(xí)，這個(gè)問(wèn)題便迎刃而解。

5.2.2設(shè)置問(wèn)題串，引導(dǎo)學(xué)生構(gòu)建實(shí)驗(yàn)思路

教師提出問(wèn)題：血紅蛋白的結(jié)構(gòu)有什么特點(diǎn)，具有哪些特性？并組織學(xué)生閱讀教材中血紅蛋白結(jié)構(gòu)的相關(guān)文字。教師繼續(xù)設(shè)問(wèn)：了解了血紅蛋白的結(jié)構(gòu)，應(yīng)該選擇什么樣的實(shí)驗(yàn)材料提取血紅蛋白？為什么？選好材料以后，如何從中分離出血紅蛋白呢？首先應(yīng)該了解血液中除血紅蛋白外還含有哪些成分？教師利用一系列問(wèn)題，引導(dǎo)學(xué)生分析血液的成分，尋求獲得血紅蛋白的思路。最后，學(xué)生閱讀教材并思考：若整個(gè)實(shí)驗(yàn)按照上述思路完成，實(shí)驗(yàn)分為幾個(gè)環(huán)節(jié)？從而過(guò)渡到“樣品處理”環(huán)節(jié)。

5.2.3樣品的處理

教師在講解原理階段，先提出問(wèn)題：樣品處理分為幾個(gè)環(huán)節(jié)？紅細(xì)胞洗滌干凈的標(biāo)準(zhǔn)是什么？為什么要低速短時(shí)離心？洗滌的目的是什么？怎樣才能讓紅細(xì)胞破裂使其中的血紅蛋白析出呢？學(xué)生根據(jù)已有的經(jīng)驗(yàn)很容易想到“吸水漲破”的方法。教師繼續(xù)設(shè)問(wèn)：為了加速釋放過(guò)程，采取了什么措施？這樣做的目的是什么？這時(shí)，紅細(xì)胞破裂，蛋白質(zhì)釋放，同時(shí)也有很多的細(xì)胞內(nèi)容物和殘留細(xì)胞膜，此時(shí)離心管中的成分比較復(fù)雜，接下來(lái)該做什么？學(xué)生會(huì)想到下一步的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，過(guò)渡到下一步“分離血紅蛋白溶液”。教師提出問(wèn)題：采用什么方法分離血紅蛋白？離心分層后，各層的成分是什么？用濾紙過(guò)濾，去除了什么成分？教師引導(dǎo)學(xué)生找到所需要的那一層，讓學(xué)生從宏觀(guān)上明確血紅蛋白所處的位置，并思考：用什么方法可以得到這一層物質(zhì)？通過(guò)閱讀教材，學(xué)生可以找到“過(guò)濾”的方法。教師繼續(xù)設(shè)問(wèn)：過(guò)濾掉的是什么？如何獲得下層的血紅蛋白溶液？學(xué)生很容易想到利用分液漏斗獲取。由于此時(shí)的血紅蛋白水溶液仍含有很多雜質(zhì)，教師提出用透析法進(jìn)行粗分離去除雜質(zhì)。

在實(shí)踐提升階段，教師組織學(xué)生進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室對(duì)采集的牛血進(jìn)行樣品的處理（紅細(xì)胞的洗滌、血紅蛋白的釋放、分離血紅蛋白溶液）。

5.2.4粗分離——透析

在原理講解階段，教師播放多媒體動(dòng)畫(huà)，讓學(xué)生理解透析的原理：透析只能去除小分子雜質(zhì)，蛋白質(zhì)進(jìn)一步純化要用凝膠色譜法。接著，教師組織學(xué)生進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作環(huán)節(jié)，將理論與實(shí)踐相結(jié)合。

在實(shí)踐提升階段，教師組織學(xué)生對(duì)分離得到的血紅蛋白溶液進(jìn)行粗分離——透析。

5.3第二課時(shí)：凝膠色譜法

在原理講解階段，教師提出問(wèn)題：凝膠色譜法用到一種特殊材料，具有什么特點(diǎn)？然后播放凝膠色譜的動(dòng)畫(huà)，進(jìn)一步強(qiáng)化學(xué)生對(duì)凝膠色譜法原理的理解，并追問(wèn)：凝膠色譜法的實(shí)驗(yàn)具體怎么操作的呢？學(xué)生通過(guò)閱讀教材很容易得出凝膠色譜法的實(shí)驗(yàn)分四步：凝膠色譜柱的制作一凝膠色譜柱的裝填一樣品的加入和洗脫一收集樣品。教師繼續(xù)設(shè)問(wèn)：凝膠顆粒是怎么填的？凝膠材料如何選擇？G的含義是什么？在裝填凝膠之前還應(yīng)該對(duì)凝膠進(jìn)行什么處理？為了加速膨脹還可以如何處理？在裝填過(guò)程中需要注意什么？如果色譜柱內(nèi)有氣泡行嗎？教師利用問(wèn)題，引導(dǎo)學(xué)生思考在裝填過(guò)程的注意事項(xiàng)：色譜柱內(nèi)存在氣泡，會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫順序，降低分離效果。教師提出質(zhì)疑：這樣裝填就結(jié)束了嗎？從而引入最后一步洗滌平衡，并提出問(wèn)題：什么時(shí)候開(kāi)始收集樣品？

在實(shí)踐提升階段，教師組織部分學(xué)生去大學(xué)實(shí)驗(yàn)室，利用蛋白純化系統(tǒng)對(duì)樣品進(jìn)行純化，錄成視頻。課上播放視頻，讓學(xué)生直觀(guān)地理解凝膠色譜法的具體操作過(guò)程。接著，要求學(xué)生判斷流出來(lái)的物質(zhì)是血紅蛋白，由此過(guò)渡到SDS-PAGE電泳的教學(xué)。

5.4第三課時(shí)：SDS-PACE電泳

5.4.1純度鑒定-SDS-PAGE電泳

在原理講解階段，教師引導(dǎo)學(xué)生閱讀教材找出電泳的概念：“指帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程”。引導(dǎo)學(xué)生利用物理學(xué)知識(shí)，分析電泳的原理：蛋白質(zhì)在一定的pH下，羧基電離帶負(fù)電，而氨基水解帶正電，但一般情況下認(rèn)為蛋白質(zhì)帶負(fù)電，在電場(chǎng)的作用下，蛋白質(zhì)分子向凝膠的正極端遷移。教師補(bǔ)充提問(wèn)：“電泳除了利用蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，還利用了蛋白質(zhì)的哪些特性？”學(xué)生參照教材圖，可發(fā)現(xiàn)：凝膠是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使小分子容易通過(guò)，而大分子不易通過(guò)。因此，學(xué)生得出結(jié)論：除了利用蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，還利用了蛋白質(zhì)分子本身的大小和形狀。學(xué)生閱讀教材小字部分內(nèi)容，了解凝膠電泳的種類(lèi)及原理。教師設(shè)問(wèn)：“為了使電泳只受到蛋白質(zhì)分子大小的影響，而不受帶電性質(zhì)的影響，加入哪種化學(xué)試劑？SDS是怎么做到的？”引導(dǎo)學(xué)生在教材中找到SDS的作用。教師補(bǔ)充提問(wèn)：“除此之外SDS還有什么作用？”這個(gè)問(wèn)題讓學(xué)生了解到SDS使蛋白質(zhì)完全變性，將蛋白質(zhì)解聚成單鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。

在實(shí)踐提升階段，教師講解完電泳原理之后，帶領(lǐng)學(xué)生進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)際操作（蛋白樣品處理、加樣、電泳、剝膠、染色、脫色、觀(guān)察）。

5.4.2知識(shí)遷移，學(xué)以致用

教師展示圖2，圖中1～15泳道代表不同的血紅蛋白病或者正常人，讓學(xué)生思考：如何檢測(cè)新生兒是否患有血紅蛋白疾病呢？請(qǐng)說(shuō)出實(shí)驗(yàn)思路。然后，教師再介紹一種全自動(dòng)毛細(xì)血管電泳法進(jìn)行血紅蛋白的檢測(cè)，讓學(xué)生了解科技前沿。

5.5課堂小結(jié)

教師板書(shū)本節(jié)課血紅蛋白提取和分離的過(guò)程，每一步用到的技術(shù)，各項(xiàng)技術(shù)的原理及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的注意事項(xiàng)。

6教學(xué)反思

本節(jié)實(shí)驗(yàn)課以血紅蛋白作為“主線(xiàn)分子”，包括了樣品的處理、透析、凝膠色譜法、SDS-PACE法等4個(gè)子實(shí)驗(yàn)。本節(jié)課的難點(diǎn)在于凝膠色譜法和SDS-PACE法的原理比較難懂。為了突破此難點(diǎn)，筆者采用“先講解原理后實(shí)踐提升”的教學(xué)策略，讓學(xué)生通過(guò)實(shí)際操作將實(shí)驗(yàn)原理內(nèi)化。在講解每個(gè)子實(shí)驗(yàn)時(shí)，通過(guò)設(shè)置問(wèn)題串，激發(fā)學(xué)生思考，從而理解實(shí)驗(yàn)操作步驟的原理及目的。