地塞米松體外短期處理抑制CD8 T細胞的活化與功能

謝 婷，歐志兵，黃麗艷，張 健，金 坤，瞿小旺，劉文培，羅迪賢

(1南華大學附屬郴州醫院轉化醫學研究所,2南華大學附屬郴州醫院肝膽外科,湖南郴州423000)

0 引言

糖皮質激素具有強大的抗炎和免疫抑制作用,通過抑制促炎細胞因子、激活抗炎細胞因子以及趨化因子來影響免疫應答,因而廣泛用于自身免疫性和炎癥性疾病治療。研究表明,糖皮質激素可以調節影響先天免疫和適應性免疫的各種免疫細胞的功能,但其介導的調節作用機制仍未完全闡明。CD8T細胞即細胞毒性T細胞可通過誘導靶細胞凋亡、分泌細胞因子抑制靶細胞或分泌穿孔素(perforin)和顆粒酶直接殺死靶細胞。細胞毒性T淋巴細胞抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)、程序性死亡受體-1(programmed cell death 1,PD-1)、淋巴細胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3,LAG-3)和T細胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(T-cell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule,Tim-3)是表達于T細胞表面的抑制性受體。在穩態條件下,通過抑制性受體的信號傳導來平衡共刺激受體的活性,確保免疫應答正常啟動并發揮作用,當信號傳導失控時將導致惡性激活和自身免疫。T盒轉錄因子(T-box expression in T cells,T-bet)和脫中胚蛋白(eomesodermin,Eomes)協同調節CD8效應性T細胞分化,調節功能性細胞因子γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、顆粒酶 B(granzyme B,GzmB)、穿孔素(Perforin)的表達,與記憶CD8 T細胞轉換與維持有關。 Eomes在大多數脊椎動物胚胎發育過程起重要調節作用,慢性病毒感染期間,T-bet和Eomes的差異表達促進了抗病毒CD8T細胞庫的協同維持。

本研究通過糖皮質激素體外短期處理健康人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),探討其對CD8T細胞表型、功能的影響及可能作用機制,為糖皮質激素在臨床應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 收集2017年11月至2018年8月無糖皮質激素使用史的健康志愿者外周血,剔除感染如乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、人類免疫缺陷病、梅毒等感染性疾病樣本。該研究在南華大學附屬郴州市第一人民醫院倫理委員會和志愿者知情同意下進行。本次研究對象共32例,男28例,女4例,年齡為(32.09±5.306)歲。

1.1.2 主要試劑 以下試劑購自eBioscience公司：兔抗人CCR7 PE 610(3D12)；鼠抗人CD3 APC-eFluor780(SK7)、CD8 PerCP-Cy5.5(RPA-T8)、CD38 APC(HIT2)、Perforin FITC(dG9)、LAG3 FITC(3DS223H)、PD-1 PE-eFluor 610(eBioJ105)、 T-bet PE-Cyanine7(eBio4B10)、 Eomes APC(WD1928)；Brefeldin A、Human TruStain FcX(Fc Receptor Blocking Solution)、Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set。鼠抗人CD8 BUV737(SK1)、CD45RA FITC(HI100)、HLA-DR PE(G46-6)、TNF-α PE-Cy7(MAb11)、IFN-γ PE-CF594(B27)、Granzyme B PE(GB11)、Annexin V PE、 7-AAD PE-Cyanine5、Fixation/Permeabilization Solution Kit等試劑購自BD Biosciences公司。鼠抗人 Tim-3 PE(344823)購自 R＆D。Dexamethasone、PMA、Ionomycin購自 Sigam-Aldricha公司。1.1.3 儀器與軟件 MoFlo XDP流式細胞分選儀(Beckman公司)獲取并分析細胞、軟件FlowJo V10.0分析流式數據、軟件GraphPad Prism 7作圖。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理與地塞米松刺激 收集健康自愿者外周血6～10 mL,將外周血(血 ∶淋巴細胞分離液＝2：1)沿管壁緩慢加入至含分離液的離心管中,2200 rpm離心22 min。離心后吸取中間單個核細胞層,加至含10 mL RPMI 1640洗液的15 mL離心管中,混勻后1800 rpm離心10 min,棄上清,加細胞凍存液凍存于液氮罐中備用。復蘇細胞過夜后,加1 mL含10%FBS的RPMI 1640完全培養基重懸細胞后計數。調整細胞濃度至1×10/mL,同一樣本分兩孔,每孔100 μL接種于96孔平底板中。并用地塞米松(終濃度為10～10mol/L)或完全培養基按總體積 200 μL/孔處理,37℃、5%CO培養箱中培養3 d。

1.2.2 細胞表面染色 將刺激后的細胞轉移至96孔V底板中,Live/Dead 1∶1000稀釋至工作濃度后,100 μL/孔4℃ 避光染色30 min,以分析時排除死細胞。細胞表面染色前,25 μL/孔染含5%Human TruStain FcX抗體懸液,4℃ 避光染色5 min,按抗體最適濃度、根據不同panel配制總體積50 μL/孔抗體懸液染色 CD3、CD8、CD45RA、CCR7、CD38 、HLADR、LAG-3、CTLA-4等抗體,4℃ 避光染色30 min,含1%FBS的staining buffer洗滌三次后流式上機檢測。

1.2.3 胞內細胞因子分泌檢測 地塞米松處理PBMCs三天后,需檢測胞內細胞因子則將細胞轉移至96孔U底板中,PMA(50 ng/mL)+Ionomycin(1 μg/mL)再刺激6 h,開始刺激1 h后每孔加Golgistop(工作濃度1∶1500)以阻斷細胞內細胞因子釋放至胞外。細胞表面染色后,staining buffer洗滌細胞3次,Fixation/Permeabilization solution 100 μL/孔混勻后 4℃ 避光孵育20 min,BD Biosciences洗液洗滌細胞2次。按50 μL/孔體系加 GzmB、Perforin、TNF-α、IFN-γ 抗體,4℃ 避光染色30min,staining buffer洗滌三次后流式上機檢測。

1.2.4 轉錄因子染色 表面染色后,Foxp3/Tran-scription Factor Staining Buffer按說明書配至工作濃度,100 μL/孔室溫避光孵育40 min后,eBioscience洗液洗滌細胞2次,按50 μL/孔體系染色 Eomes、T-bet抗體,4℃ 避光染色30 min,staining buffer洗滌細胞3次后流式上機檢測。

1.2.5 細胞凋亡檢測 細胞經表面染色后,用預冷的PBS洗滌細胞兩次后用1X binding buffer調整細胞濃度至2×10/mL,轉移50 μL/孔至96孔V底板中。每孔加入7-AAD、Annexin v抗體室溫避光孵育15 min。 加 200 μL/孔 1X binding buffer后 1 h 內流式上機檢測細胞凋亡情況。

1.3 統計學處理 實驗數據采用SPSS24.0統計分析,計量資料用x ±s表示,兩組間比較采用配對t檢驗,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 地塞米松體外短期處理顯著降低效應性CD8T細胞比例，改變細胞亞群分布 為明確地塞米松對CD8T細胞的影響,本研究采用地塞米松(10～10mol/L)處理健康人PBMCs 3天,發現地塞米松(10～ 10mol/L)均減少 CD8T 細胞比例(圖1B),且呈劑量依賴。根據該結果,本實驗后期均選擇10mol/L地塞米松作為處理濃度。我們進一步檢測據CD45RA、CCR7的表達定義的CD8T細胞四個亞群(圖1A),發現與對照組相比,初始 T細胞比例顯著增加(＜0.001),而效應T細胞比例顯著減少(＜0.001)(圖1C)。這些結果表明,地塞米松體外短期處理主要降低效應性CD8T細胞比例。

圖1 地塞米松短期處理改變CD8+T細胞及其亞群分布

2.2 地塞米松體外抑制CD8T細胞活化，促進效應性T細胞晚期凋亡 為進一步探討地塞米松體外短期處理對CD8T細胞的影響,我們檢測了CD8T細胞及其亞群在地塞米松短期處理后其活化與凋亡情況。研究發現：與對照組相比,地塞米松抑制CD8T細胞的活化(＝0.044)(圖2A),各個亞群的活化也相應受到抑制(＝0.043、＝0.04、＝0.042、＝0.045)(圖2B)。地塞米松短期處理未見影響總的CD8T細胞凋亡(圖2C、D)。分析其亞群細胞凋亡情況,發現地塞米松處理主要促進CD8效應性T細胞、抑制初始T細胞亞群的晚期凋亡(＝0.032、＝0.033)(圖2E、F)。結合結果1,我們推測：地塞米松短期處理可能通過抑制效應性T細胞活化、促進其凋亡從而顯著下調效應性T細胞比例。

A和B：地塞米松抑制CD8+T細胞及其亞群的活化(活化標志：CD38+HLA-DR+)。C和E：早期凋亡情況。D和F：晚期凋亡情況(早期凋亡：Annexin V+7-AAD-；晚期凋亡：Annexin V+7-AAD+)。 藍色柱：Medium紅色柱：Dex。注*與Medium比較,P＜0.05

2.3 地塞米松體外短期處理促進CD8T細胞耗竭

免疫抑制性受體如 PD-1、Tim-3、CTLA-4、LAG-3 等通常在T細胞活化后高表達,負向調節T細胞過度活化,慢性感染或炎癥同樣上調免疫抑制性受體表達,引起T細胞功能耗竭。本研究發現：地塞米松體外短期處理顯著上調CD8T細胞表面抑制性受PD-1和 Tim-3的表達(＝0.009、＝0.023)(圖 3A、B)；而LAG-3、CTLA-4比例有上升趨勢,但無統計學差異(圖3C、D)。這些結果提示,地塞米松體外短期處理可能會進一步導致T細胞功能受損。

A：LAG-3表達；B：PD-1表達情況；C：Tim-3表達情況；D：CTLA-4表達情況。藍色柱：Medium,紅色柱：Dex。注*與Medium比較,P＜0.05；**與Medium比較,P＜0.01

2.4 地塞米松體外短期處理顯著抑制CD8T細胞的功能 為進一步確認地塞米松處理對CD8T細胞功能的影響。將地塞米松短期處理過后的PBMCs,經PMA加Ionomycin刺激6 h后流式抗體胞內染色(圖4A、B),研究發現地塞米松處理組CD8T細胞功能性因子 Perforin、GzmB 表達及 IFN-γ、TNF-α 分泌顯著降低(＝0.08、＝0.001、＝0.05、＝0.022)(圖4C、D),這些結果顯示地塞米松體外短期處理抑制CD8T細胞功能。

A：典型流式圖(左圖),CD8+T細胞Perforin表達情況；B：GzmB表達情況；C：IFN-γ 表達情況；D：TNF-α 表達情況。 藍色柱：Medium,紅色柱：Dex。注*與Medium比較,P＜0.05；**與Medium比較,P＜0.01

2.5 地塞米松體外短期處理影響CD8T細胞的轉錄因子表達 如圖3、4所示,地塞米松短期處理抑制CD8T細胞功能,加速其耗竭。CD8T細胞的功能及免疫抑制性受體的表達主要受核內轉錄因子T-bet及Eomes表達的調控。與圖3和圖4所示結果一致,本研究將地塞米松短期處理過的PBMCs經破核膜后流式抗體核內染色(圖5A),發現與對照組相比,地塞米松處理顯著下調CD8T細胞核內轉錄因子Eomes表達(＜0.001),T-bet的表達無統計學差異(圖 5B),而 Eomes/T-bet的比值也呈顯著降低(＝0.005)(圖5C)。

A：典型流式圖；B：CD8+T細胞核內 T-bet及 Eomes頻數；C：Eomes/T-bet的比值。藍色柱：Medium,紅色柱：Dex。注**與Medium比較,P＜0.01,***與Medium比較,P＜0.001

3 討論

糖皮質激素具有免疫抑制和抗炎作用,也有研究表明皮質類激素可以增加免疫及炎癥反應甚至增加適應性免疫應答。CD8T細胞是適應性免疫應答的重要參與者,通過細胞毒性如GzmB和Perforin介導非細胞毒性功能來影響靶細胞；也可以通過表達CD95L(Fas)以Fas-Fas L依賴性方式誘導細胞凋亡；或者直接分泌促炎細胞因子 IFN-γ、TNF-α 維持局部炎癥。活化的T細胞上通常上調表達免疫抑制性受體：如CTLA-4上調,在維持細胞內免疫控制和外周耐受中發揮重要作用；LAG-3負調節T細胞活化和增殖；Tim在過敏和自身免疫性疾病中發揮著新的作用；PD-1作為效應T細胞應答的負調節劑,防止過度活化效應T細胞的免疫病理損傷。

本研究發現地塞米松體外短期處理PBMCs減少CD8T細胞比例,且呈劑量依賴。與體外激素處理初始 CD8T 細胞結果一致,Chen 等在小鼠模型上也有報道。進一步檢測亞群發現,效應T細胞比例減少,而初始T細胞比例顯著增加。Giles等也報道地塞米松增加初始 T細胞,減少效應記憶細胞的頻率。T細胞凋亡及活化在維持免疫穩態中起重要作用,檢測地塞米松對CD8T細胞活化及凋亡的影響,發現CD8T細胞及其四個亞群上CD38HLADR細胞頻數均減少,初始T細胞晚期凋亡比例減少,而效應T細胞晚期凋亡比例增加。提示地塞米松可抑制CD8T細胞及其亞群的活化,影響亞群間的凋亡比例從而改變CD8T細胞亞群間的分布。Carol等報道多發性硬化癥患者靜脈注射甲潑尼龍后激活的CD8T細胞比例減少。Yi等在小鼠模型上證實地塞米松處理可使胸腺細胞凋亡百分比增加。這些結果表明,地塞米松體外短期處理,主要通過抑制效應性CD8T細胞的增殖和促進其凋亡從而降低效應性T細胞頻率,從而達到免疫抑制作用。

一方面,地塞米松體外短期處理通過減少效應性T細胞數量；另一方面本研究發現地塞米松體外短期處理同時抑制T細胞功能。地塞米松處理后CD8T細胞上 PD-1和Tim-3表達顯著上調,其與 Kailin Xing等報道,地塞米松以劑量依賴的方式增強激活T細胞上PD-1的表達研究一致。Fourcade等研究報道PD-1和 Tim-3上調將導致腫瘤特異性CD8T細胞功能失調,抑制其活化,當協同使用受體拮抗劑后,部分CD8T細胞數量及功能得以恢復。糖皮質激素的免疫抑制作用在于調節基因的轉錄,并抑制細胞因子如IFN-γ、TNF-α、白介素2等分泌。本研究發現地塞米松處理后CD8T細胞功能性細胞因子 GzmB、Perforin、IFN-γ、TNF-α 比例均顯著減少,提示CD8T細胞功能受損。有研究表明：糖皮質激素幾乎可完全阻斷GzmB的產生,體外顯著減少T細胞上 IFN-γ、自然殺傷細胞上 perforin的表達。進一步檢測轉錄因子發現：地塞米松處理組CD8T細胞上T-bet無明顯變化,但Eomes頻率、Eomes/T-bet的比值顯著降低。提示地塞米松破壞Eomes與T-bet之間的轉錄平衡,許多研究報道炎性細胞因子可反向調節記憶CD8T細胞中T-bet和Eomes的表達水平。CD8細胞耗竭的幾種關鍵指標為：抑制性受體 PD-1、LAG-3、Tim-3、CTLA-4 等高表達；共刺激受體CD278和OX40的表達降低；轉錄因子T-bet、Eomes等的差異表達。 由于激素受體在免疫細胞上普遍高表達,本研究不能排除地塞米松處理增加其他免疫抑制性細胞如Treg,Tr1(本實驗室前期已發表數據),從而間接抑制CD8 T細胞活化及功能的可能性。

綜上,地塞米松體外短期處理一方面可抑制效應性CD8T細胞的分化,促進凋亡,降低效應性T細胞比率；另一方面抑制CD8T細胞功能促進T細胞耗竭,從而發揮其免疫抑制作用。本研究初步揭示了地塞米松對外周血CD8T細胞的影響及可能的機制,這些研究結果將為糖皮質激素在臨床應用中,對免疫細胞調節提供一定的理論參考。由于本研究為體外實驗,具有一定的研究局限性,下一步將有必要深入探討糖皮質激素受體及其相關調節機制的研究,并在不同的免疫性疾病條件下,探討激素對CD8T細胞免疫抑制的可能機制。