論多肽的固相合成法研究進展

閆鳳

摘要：在生物工程中，對多肽的研究是重要的一項工作內容。隨著社會的發展，合成多肽類生物活性物質對于生物工程技術的發展有著越來越重要的意義。下文介紹了多肽合成的原理方法和現階段的問題，并對其研究進展作了具體闡述。

關鍵詞：多肽；固相合成法；生物；氨基酸

引言

多肽是一種由氨基酸組成并廣泛存在于生物體內的重要化學物質。就目前而言，研究人員已經在生物體內發現數萬種多肽物質。在實踐中，由于多肽具有良好的安全性和生物活性，所以日益受到生物研發人員的重視。隨著我國生物工程的發展和社會經濟的進步，多肽固相合成技術已經日臻成熟，其工藝穩定性和安全性都有所提高。

1相合成的基本原理

多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，合成一般從C端羧基端）向N端（氨基端）合成。首先將目的肽第一個氨基酸的羧基以共價鍵的形式與固相載體相連，再以這一氨基酸的氨基為合成起點，經過脫去氨基保護基并同過量的活化的第二個氨基酸反應，接長肽鏈。重復（縮合→洗滌→去保護→中和及洗滌→進一步縮合）操作，達到所要合成的肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經過純化等處理，即得所要的多肽物質。

2多肽固相合成法現階段的問題

現階段，雖然經過研究人員的不斷改進和完善，多肽固相合成法已經能夠合成很多具有生物活性的多肽和蛋白質，但其本身還存在著很多問題與缺陷，如直接合成的序列短、所需時間長、合成的效率和純度低、成本高等，這些問題都限制了多肽固相合成法的應用范圍。

2.1合成多肽的序列短

自從BMerrifield發明了多肽固相合成法后，多肽的化學合成成為蛋白質大量重組表達的有效輔助工具，被廣泛應用于結構生物學、免疫學、蛋白質工程和生物藥物研究中。盡管在肽鏈合成后的性質、分析等方面都有很大提高，但是當肽鏈殘基大于三十個，尤其超過五十個時，肽鏈的合成就會受到一定程度的制約。多肽固相合成被局限于小片段多肽的合成。

2.2合成效率及純度不高

對于富含二硫鍵和堿性氨基酸殘基的多肽固相合成，即使是在30個氨基酸以內，仍比較困難，一部分多肽不能成功合成。隨著氨基酸數量的增加，合成效率逐步下降，非目的肽含量逐步增長，目的肽的純度相應降低，后續的純化和重復性愈加困難。合成多肽的樹脂和保護氨基酸等原料昂貴，多肽合成的成本高，還不能完全滿足作為藥物商業化生產的要求。

2.3合成時間長

經過幾十多年的發展，多肽固相合成的速率取得了很大提高，但是相對其他合成方式（如生物合成法）來說，肽鏈的合成速率仍然很慢。每結合上一個氨基酸大約需要二十到一百二十分鐘，平均一個九肽的合成需要五小時以上。另外，當合成結構較復雜的多肽序列時，鏈的結合時間更長。

2.4合成試劑的毒性大

DCM、DMF為多肽固相合成的首選試劑，其應用量大、毒性高，對身體及周邊環境危害大。這些有機化學試劑成為廢液后均需要報環保局進行處理。在合成過程中應用的儀器大多可在全封閉條件下進行，但其排出的廢氣、廢液等，對環境仍有一定的污染，不能保證百分百安全。因此，隨著多肽固相合成法的發展與廣泛應用，國家對研制開發出新型的、危害小的合成試劑的需求越來越迫切。

3合成方法

3.1Boc合成法

采用三氟乙酸（TFA）可脫除的Boc為α-氨基保護基，側鏈保護采用芐醇類。合成時將一個Boc保護的α-氨基酸共價交聯到樹脂上，用TFA脫除Boc，三乙胺中和游離的氨基末端，然后通過DCC活化、偶聯下一個氨基酸，最終采用強酸HF法或三氟甲磺酸將合成的目標多肽從樹脂上解離。在Boc合成法中，由于要反復地用酸來脫保護以便進行下一步的偶聯，這就引入了一些副反應，如多肽容易從樹脂上切除下來，氨基酸側鏈在酸性條件不穩定并發生副反應。

3.2Fmoc合成法在Fmoc法

研究人員采用了可被堿脫除的Fmoc作為α-氨基酸的保護基，側鏈采用酸脫除的Boc保護方法。Fmoc作為氨基保護基的優點在于它對酸穩定，用TFA等試劑處理不受影響，僅需用溫和的堿處理，側鏈用對堿穩的Boc進行保護等。肽段最后用TFA/二氧甲烷定量地從樹脂上切除，避免了采用強酸。Fmoc法與Boc法相比，由于Fmoc法反應條件溫和，副反應少，產率高，而被廣泛應用于多肽合成中。

3.3固相合成的聚合物載體的選擇

將固相合成與其他多肽合成技術分開來的最主要的特征是固相載體，而能被用作多肽固相載體的聚合物必須滿足以下條件：第一，必須包含合適的連接分子或反應基團，使肽鏈能連接在載體上面，并在以后除去。第二，必須提供足夠的連接點，以滿足肽鏈不斷增長的需要。第三，必須在合成過程中保持穩定并且不與氨基酸分子反應。目前用于固相合成的聚合物載體主要有三類：聚丙烯酰胺、聚苯乙烯-苯二乙烯交聯樹脂、聚乙烯—乙二醇類樹脂及衍生物。這些聚合物載體只有引入相應的連接分子，才能與氨基酸進行連接。根據連接分子的不同，樹脂又被分為以下幾種：羧基樹脂、氯甲基樹脂、氨基樹脂或酰肼型樹脂。

3.4連接分子

一個理想的連接分子必須在整個合成過程中十分穩定，并在合成后可以定量的切割下來而又不破壞合成的目標分子，同時連接分子還需要根據與樹脂相連的肽的C端的結構類型，裂解后生成的羧酸、酰胺或氨基醇等衍生物來選擇。固相多肽合成使用過的連接分子為含有對苯甲?；?、氯甲基、巰甲基、丁鄰硝基芐醇基及二苯氯硅烷等的雙官能團化合物。

3.5肽鍵的形成

固相中肽鍵的形成原理與液相中的基本一致，應用的方法主要有縮合劑法、混合酸酐法、酰氯法、活化酯法和原位法等，其中DCC、HOBT或HOBT/DCC的對稱酸酐法、活化酯法由于在肽鍵的形成過程中可以減少副反應并抑制消旋的發生，最終得到的多肽收率高等優點而應用最廣。

3.6多肽的切割與純化

按既定的順序合成完多肽后，就要把目標多肽從樹脂上切割下來，并進行進一步的純化。由于多肽的合成有Boc法和Fmoc法兩種，因此，它們的切割方法也不完全一樣。在Boc法中，主要用TFA+HF裂解和脫側鏈保護。在Fmoc法中直接用TFA進行切割。合成肽鏈進一步的精制、分離與純化通常采用親和層析、高效液相色譜、毛細管電泳等方法來實現。

結束語

多肽固相合成法自研究以來，已經在工藝上了很大改進，隨著人們對生物化學領域關注度的增高，多肽固相合成法研究工作的重要性日益凸顯了出來。研究人員如何進一步優化其純度，有效去除雜質是研究工作的重點內容。多肽雜質譜具有比較高的復雜性，為此，研究人員需結合多肽的結構特點，加強固相合成工藝研究與控制，建立相應的研究控制策略，盡可能地降低潛在雜質的生成，保證多肽產品的質量。

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