血清體積分數對培養黑山羊成纖維細胞的影響

張榮華 ，王 曦 ，鄭彥偉 ，李武峰

（1.山西農業大學生命科學學院，山西 太谷 030801；2.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西 太原 030032；3.和順縣農業委員會，山西 和順 032700）

黑山羊主要分布在云南、四川等海拔1 200～3 000 m的丘陵和山區地帶，而呂梁黑山羊是我國北方山區的優良種質資源之一，歷史悠久，地域性強[1]。該品種外形獨特、肉質鮮美，對常年低溫、四季降雨量變化大的氣候環境和高低不平的地勢、植被稀疏的地理環境都有著良好的適應能力。由于呂梁黑山羊屬肉皮絨毛兼用型山羊，具有較高的經濟價值，再加上其抗寒、抗病、耐粗飼，故培育優良品種及其推廣就顯得尤為重要。早在1983年，呂梁黑山羊被列入《山西省家畜家禽品種志》[2]。當時，該品種占山西全省山羊總數的40.7%，而近些年來，雖然對家畜動物的育種、繁殖發展迅猛，但對該種質資源的保護、選育和利用少之又少，更缺乏對其的研究，很多問題亟待解決。據2010年底統計，中心產區呂梁市黑山羊存欄數由從前的107萬只驟降至不足0.6萬只，瀕臨滅絕[3]。

成纖維細胞因其容易分離、培養、操作的特性，常常被當作供體細胞進行核移植，培育克隆動物。體細胞克隆是將動物體細胞移植到去核卵母細胞中，融合激活，體外培養發育成新的個體。自1996年第1只克隆羊多利誕生以來，利用成纖維細胞已經成功克隆出梅山豬[4]、山羊[5]、和牛[6]等等。但是大多數克隆所用的成纖維細胞取自胎兒，而使用出生后個體可以簡化試驗步驟，避免傷害懷孕母畜。

本試驗旨在建立、完善呂梁黑山羊耳緣成纖維細胞培養體系，為進一步的克隆試驗提供供體細胞[7]。以3月齡的呂梁黑山羊耳緣組織為試驗材料，體外制備、分離、培養成纖維細胞，對血清體積分數因素進行探究，使用活體檢測細胞數量，以求尋找最合適的條件，為進一步研究呂梁黑山羊的克隆、基因轉染、構建基因文庫等提供生物學材料。

1 材料和方法

1.1 材料

供試羊只來自山西省農業科學院畜牧獸醫研究所呂梁黑山羊克隆基地。

1.2 主要試劑與儀器

胰蛋白酶（Serva公司）、DMEM（Gibco）、胎牛血清（FBS，Gibco）、碳酸氫鈉（Sigma）、注射用青霉素鈉、DMSO（Sigma）、兩性霉素 B（Blotapped）、注射用硫酸鏈霉素、PBS（1×PBS，pH 值 7.2～7.4，Solarbio）、生理鹽水、雙蒸水、新吉爾滅、酒精，均為國產試劑。

微量移液器（Eppenderf公司，10，100，200，1 000 μL 型）、高速低溫離心機（Sigma，2-16PK型）、CO2培養箱（Therm oF orma，3131型）、電子天平（METTLER TOLEDO，AL104-IC型）、體式顯微鏡（OLYMPUS，SZX10型）、恒溫板（OLYMPUS）、摩爾基因型超純水機（上海摩勒生物科技有限公司，MO6-063型）、立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠，YXQ-LS-SⅡ型)、電熱恒溫鼓風干燥箱（上海聯進醫療器械廠，101-2-BS-Ⅱ型）、電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司，DK-8D型）、超凈工作臺（蘇凈安泰公司）、超低溫冰箱（中科美菱公司）、CK40-32PH型倒置相差顯微鏡（OLYMPUS），CK41型熒光倒置相差顯微鏡（OLYMPUS），MP120型便攜式酸度計（Thermo）。

DMEM溶液：將10 gDMEM粉末溶于800 mL純水中，加3.7 gNaHCO3，調節pH值至7.2～7.4，定容至1 L。經0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌后4℃保存備用。

細胞培養液：（1）FBS體積分數為0的培養液為 DMEM 29.3 mL＋15%（V/V）FBS 0 mL＋兩性霉素 300 μL（0.05 μL/mL）＋雙抗 400 μL；（2）FBS 體積分數為5%的培養液為DMEM 27.8 mL＋15%（V/V）FBS1.5 mL＋兩性霉素 300 μL（0.05 μL/mL）＋雙抗 400 μL；（3）FBS 體積分數為 10%的培養液為DMEM26.3 mL＋15%（V/V）FBS 3.0 mL＋兩性霉素300 μL（0.05 μL/mL）＋雙抗 400 μL；（4）FBS 體積分數為20%的培養液為DMEM 23.3 mL＋15%（V/V）FBS6.0 mL＋兩性霉素 300 μL（0.05 μL/mL）＋雙抗 400 μL；（5）FBS 體積分數為 40%的培養液為DMEM 17.3 mL＋15%（V/V）FBS 12.0 mL＋兩性霉素 300 μL（0.05 μL/mL）＋雙抗 400 μL 。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集 采集3只（1只公羊，2只母羊）3月齡呂梁黑山羊耳緣組織，除去耳緣羊毛，用75%酒精擦拭，碘伏消毒后再用酒精棉球脫碘。用采樣鉗取1 cm2左右大小的耳緣組織，置于加有PBS（含100 IU/mL青霉素＋100 IU/mL鏈霉素）的采樣管中，封口膜封口，記錄采集樣品的羊只耳號。將采樣管投入4～8℃保溫瓶中，旋緊瓶蓋，1 h內運回實驗室。

1.3.2 成纖維細胞培養 在超凈臺及實驗室紫外線消毒30 min，37℃孵育細胞培養液和PBS緩沖液2 h。

細胞制備：在超凈臺中將耳緣組織塊用75%酒精浸泡30 s。將樣本置入加有PBS的無菌培養皿中，刮除遺留毛根，去除軟骨組織，用PBS液沖洗10次；再用培養液浸泡2遍；將樣本移入35 mm培養皿中，剪碎（1 mm2左右），均勻分布在皿底，密度不宜過大；最后將培養皿倒置入38.5℃，5%（V/V）CO2和90%相對飽和濕度的培養箱中培養1 h，待樣本組織塊貼壁。顯微鏡觀察，確定貼壁后每皿加入1 mL的FBS體積分數為10%的培養液，重新放入培養箱[8]；組織塊培養6 h后，每皿加入2 mL的FBS體積分數為10%的培養液；2 d后觀察有無污染，有無細胞遷移出。原代培養的成纖維細胞貼壁、呈放射狀，待3～4 d后細胞匯合，呈長梭狀。

細胞換液：每2 d換一次培養皿中的10%FBS細胞培養液，每皿2 mL，培養液要提前孵育2 h。由于原代細胞生長緩慢，每2 d觀察一次有無細胞遷出。

傳代培養：待原代細胞匯合度達到80%～90%時進行傳代培養。在無菌操作臺中，將培養皿中的廢液棄去，使用PBS清洗3遍，以去除殘留血清。然后每皿加入1 mL的胰蛋白酶消化液消化，置于38.5℃，5%（V/V）CO2和90%相對飽和濕度的培養箱內1 min后，顯微鏡下觀察細胞形態變化，待約80%細胞變圓、漂浮后，每皿再加入2 mL加有血清的DMEM培養液終止消化。集中吹打組織塊周圍多次，待大部分細胞懸浮后，吸取上清液加入15 mL離心管，用PBS洗滌培養皿3次，將洗滌液加入離心管；1 000 r/min離心5 min，小心棄去上清液后，用200 mL培養液懸浮沉淀后加入培養皿中，用培養液洗滌離心管3次，加入培養皿使皿中液體混合均勻，顯微鏡下觀察細胞的數量。使用血球計數板和0.4%臺盼藍染液進行活細胞計數，使細胞密度達到60%，并置于37℃，5%（V/V）CO2和90%相對飽和濕度培養箱中分皿繼續培養。操作過程在恒溫板上進行。

傳代后每天觀察細胞的生長情況。大部分傳代細胞在12 h內逐漸貼壁。此時，顯微鏡可明顯觀察到有絲分裂各期細胞的分裂相。同時，培養基中有少量懸浮細胞，這些細胞在傳代過程中受損而死亡（造成這種損傷的原因可能是機械損傷、胰蛋白酶消化等）。它們可在下次換液時一同棄去。細胞傳代后生長狀況良好，速度較原代要快，且具有典型的成纖維細胞形態。

1.3.3 不同體積分數FBS下培養成纖維細胞 取正處于對數期的第3代成纖維細胞，每皿中加入1 mL胰蛋白酶消化液消化，1～2 min后每皿加入2 mL培養液終止消化。1 000 r/min離心5 min，棄上清，然后分別以不同體積分數（0，5%，10%，20%，40%）的FBS培養液重懸細胞，轉移至24孔細胞板，通過0.4%臺盼藍染色和血球計數板控制每孔1.3×105個細胞。置于 37 ℃，5%（V/V）CO2和 90%相對飽和濕度培養箱中培養。

1.3.4 細胞計數 連續7 d在相同時間使用倒置顯微鏡進行細胞形態觀察，拍照記錄，并進行活體計數、處理（圖 1～3）。

活體計數：血球計數板和蓋玻片先用酒精清潔、干燥；然后將少量等體積的細胞懸液和0.4%臺盼藍染液混合均勻染色，靜置2～3 min；輕輕吹打混合液，吸取少量液體滴在蓋玻片一側，注樣量不要溢出蓋玻片且不宜帶氣泡；待液體進入計數室時計數，死細胞為藍色，活細胞為無色透明。統計四角大方格中活細胞數，若細胞壓中線，計左和上方數。

1.4 數據處理

采用SPSS 17.0軟件（Duncan法）進行差異顯著性檢驗。

其中，DT表示細胞倍增時間，t為培養時間，N0為首次記下的細胞數，Nt為t時間后的細胞數。

2 結果與分析

2.1 細胞形態學觀察結果

用胎牛血清體積分數分別為0，5%，10%，20%，40%的培養液培養成纖維細胞的情況各不相同，所有試驗組細胞均在培養6 h后貼壁，形態良好，成梭形，透亮折光度較好。其中，10%試驗組細胞能看到細胞中心的細胞核；40%試驗組細胞最早出現大量細胞形態不完整、細胞懸浮等現象；每組當培養皿底鋪滿80%時，發生接觸抑制，生長趨勢緩慢[12]。

2.2 臺盼藍染色檢測活細胞數目結果

每組差別較大，根據FBS體積分數的不同，以培養天數為橫坐標，耳緣成纖維細胞數量為縱坐標繪制曲線（圖4）。由圖4可知，0培養組細胞生長緩慢，數量少，細胞狀態也沒有明顯變化。5%，10%和20%血清體積分數培養組細胞生長狀態良好，在3～5 d時達到對數生長期，生長速度較快，平均細胞數目多，其中，生長趨勢最好的是10%試驗組，活細胞最多，細胞生長曲線呈S形；其次是5%試驗組，細胞狀態良好，但5 d后細胞增長沒有10%試驗組的細胞迅速；5 d后，這3組培養組的細胞生長趨勢變緩，最為明顯的是20%培養組，死亡細胞數目增多，可能與細胞膜受損有關[13]。而40%培養組由于血清濃度過高，細胞數量的增加幾乎處于停滯狀態，維持一段時間后從第3天就開始衰退，且5～7 d比3～5 d衰退迅速，在5組中細胞數量最少，長勢最差。綜上所述，培養液中FBS的體積分數對成纖維細胞生長影響較明顯。FBS體積分數為5%，10%，20%試驗組對細胞生長狀況的影響差異不顯著（P＞0.05），其中，10%培養組對細胞生長最有利；但三者與0，40%試驗組間差異顯著（P＜0.05），且0與40%試驗組間差異也顯著（P＜0.05）。

3 討論與結論

哺乳動物克隆是近年來生物領域的研究熱點[14]。克隆技術不僅可用于改良優化品種、保護瀕危動植物，也可用于治療疾病、針對性生產生物反應器等[15]。耳緣成纖維細胞作克隆供體細胞具有一定的優勢，它易分離、易培養，同時增殖能力較強，即使多次傳代后細胞狀態和增殖能力仍良好。而血清是培養供體細胞最有效的生物液體之一[16]。其中的生長因子、激素等物質對成纖維細胞的生長具有重要作用。但血清的成分復雜，也包含很多有害因子，如血清細胞毒作用等[17]。所以，血清體積分數對培養成纖維細胞至關重要。

本試驗發現，不同體積分數血清的培養液對黑山羊耳緣成纖維細胞有一定影響。0血清體積分數組，細胞由于無血清，營養低，所以數量變化小；5%血清體積分數組細胞數量比0多，狀態好，可增殖，但仍比10%，20%組慢；10%和20%血清體積分數組的細胞狀態較好，數量較多，但20%組后期可能有膜受損現象，衰亡的比較多。由臺盼藍染色可知，10%試驗組是5組中活細胞數目最多、生長狀態最好的，因此，其是體外成纖維細胞培養的最適血清體積分數。而40%血清體積分數組的細胞在后期數量下降劇烈，說明血清濃度過高不適宜成纖維細胞的體外培養。綜上所述，培養液中胎牛血清體積分數直接影響到后續以其為供體細胞克隆呂梁黑山羊的試驗結果，所以在后續的試驗中決定選用10%血清體積分數培養液培養供體細胞。

［1］梁茂文，毛楊毅，韓一超,等.呂梁黑山羊特色產業發展思考[J].山西農業科學，2017，45（8）：1369-1371.

［2］于海平，白志宇.呂梁黑山羊品種資源亟待保護和利用[J].中國畜禽種業，2010（12）：57-58．

［3］高晉生，程俐芬，張明偉，等.呂梁黑山羊遺傳資源調查報告[C]//2012年中國羊業進展論文集.懷仁：中國畜牧業協會，2012.

［4］張德福，吳彩鳳.梅山豬耳成纖維細胞體外培養及其克隆[J].中國獸醫學報，2014（7）：1188-1190.

［5］王玉閣，鄒賢剛.由胎兒成纖維細胞而來的克隆山羊[J].科學通報，1999（21）：2319-2323.

［6］RI KWANGI L.和牛體細胞克隆技術的研究與應用 [D].北京：中國農業科學院，2015.

［7］李希，王曦，吳蘇君，等.呂梁黑山羊的體細胞克隆[J].山西農業科學，2017，45（12）：2001-2005.

［8］閆益波，李文剛，焦福林，等.豬卵巢顆粒細胞分離培養及細胞生物學特性研究[J].山西農業科學，2016，44（6）：825-828.

［9］程騰，李佳佳，賀小英，等.培養方法及胎牛血清濃度對人胎兒成纖維細胞體外生長的影響 [J].信陽師范學院學報，2013，4（26）：523-526.

［10］王煒，楊磊，王海東，等.同濃度血清對肝細胞原代培養的影響[J].農業技術與裝備，2009（2）：42-43.

［11］ DENG J P，DAI Z Q，LIU S，et al.Isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells by red blood cell lysis method[J].Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research，2007（3）：579-582.

［12］尚楊衛.Lamininα 5在肺腺癌及A549細胞系不同增殖狀態中的表達[D].沈陽：中國醫科大學，2014.

［13］張麗嬌，馬瑩聰.不同血清濃度對小鼠肺細胞原代培養的影響[J].黑龍江畜牧獸醫，2016（11）：208-209．

［14］ ENYA S，KAWARASAKI T，OTAKE M，et al.Preservation and reproduction of microminipigs by cloning technology[J].Vivo，2016，30（5）：617.

［15］張榮華，王曦，李武峰.哺乳動物克隆技術研究進展[J].山西農業科學，2017，45（9）：1577-1582.

［16］馬忠仁，馮玉萍，李倬.動物血清在細胞培養中的重要性及其質量控制標準[J].西北民族大學學報（自然科學版），2003，24（3）：56-58.

［17］張明森，李素芝.血清濃度對高原體外肝細胞培養的影響[J].實用預防醫學，2006，13（4）：823-825.