大豆脂肪氧化酶研究進展

劉 博 ，衛 玲 ，肖俊紅 ，楊海峰 ，段學艷 ，陳愛萍 ，任瑞蘭 ，肖 磊

（1.山西省農業科學院小麥研究所，山西 臨汾 041000；2.邯鄲市農業科學院，河北 邯鄲 056001）

脂肪氧化酶是一類含非血紅素鐵、不含硫的過氧化酶，球型，可溶，無色，其分子量在動物中為75～80 ku，植物中為90～104 ku，其在動植物和微生物中普遍存在，在真核細胞生物中參與不飽和脂肪酸的代謝[1-5]。

1932年，脂肪氧化酶（簡稱Lox）首次在大豆中被發現[6]，它僅占大豆總蛋白的1%～2%[7]，但是能夠專一催化多元不飽和脂肪酸的加氧反應，形成具有共軛雙鍵脂肪酸氫過氧化物。這些產物經過解裂酶分解，產生醇、酮、醛類等揮發性物質，進而形成豆腥味[8-10]。脂肪氧化酶及其代謝產物一方面在植物營養生長、防御反應、抗逆性等方面具有積極作用；另一方面造成了豆腥味等不良氣味產生、降低了大豆的營養品質，在一定程度上縮短了大豆的儲藏期。因此，研究大豆脂肪氧化酶具有非常重要的意義。

從遺傳機制及育種改良、檢測技術與手段方面綜述了大豆脂肪氧化酶的研究進展，旨在為相關研究提供借鑒和參考。

1 脂肪氧化酶遺傳機制及育種改良

1.1 國外研究

20世紀40年代和70年代，THEORELL等[11-13]先后分離純化了大豆脂肪氧化酶的3種同工酶Lox1，Lox2 和 Lox3 （Lox3a，Lox3b），其中，Lox3a，Lox3b在許多性質上相似，被認為是同一種同工酶。3種酶同源性較高，同源序列中N末端均有氨基酸組成的桶狀結構，C末端均有一段氨基酸保守區域，該區域作為酶蛋白活性中心，從而調節酶活性。當3種酶對應基因均為隱性（即lx1，lx2，lx3）時，Lox1，Lox2和Lox3全缺失，豆腥味全無。前人研究表明，lx1與lx2緊密連鎖，lx3獨立遺傳[14]。

1995年，日本學者NISHIBA等[15]用正常大豆與各類型Lox缺失體比較，結果發現，水狀均質豆粉中脂肪酸過氧化作用指標（DETBA值）和己醛生成量最低值均為Lox全缺失體。NISHIBA等[16]研究加水均質豆粉及豆奶維生素E含量、清除自由基（DPPH）活性的品種間差異，結果發現，Lox全缺失體有最高水平的維生素E含量和清除DPPH自由基活性，說明Lox全缺失體具有更高的營養價值。目前，國外報道，篩選出了3種類型Lox自然缺失體，并育成了以美國Century、日本Suzuyutaka近等基因系為代表的品種或種質資源，用于研究和育種。比較典型的有日本育成的低豆腥味品種“夢豐”，無豆腥味品種“中育37”，韓國育成的“真品豆”等。

1.2 國內研究

我國對脂肪氧化酶研究相對較晚。1994年，中國農業科學院作物科學研究所丁安林等[13]首先開展大豆種子脂肪氧化酶、同工酶缺失體的研究。之后，傅翠真等[17]對我國大豆脂肪氧化酶缺失種質多樣性進行了鑒定，結果表明，國內發現的Lox缺失類型為Lox1，Lox2，Lox3和Lox2.3，共4種。麻浩等[18]對不同Lox缺失體近等基因系豆腥味研究結果表明，3種酶對豆腥味貢獻程度大小為Lox2＞Lox1＞Lox3，即Lox2作用最大，Lox1作用居中，Lox3作用最小。

我國大豆研究人員在“九五”期間，建立了大豆脂肪氧化酶缺失突變基因（lx）的蛋白標記和lx1的RAPD標記1個，lx2和lx3的特異PCR標記各1個，并用這些分子標記輔助育種，育成了低豆腥味大豆新品種中黃 18（Lox2缺失）、中黃 16（Lox2.3，Ti缺失）、無腥1號（Lox2.3缺失）和一批Lox雙缺的品種或種質。劉藝苓[19]運用基因工程手段，克隆大豆脂肪氧化酶基因，同時采用種子特異型啟動子構建RNAi表達載體，以期抑制大豆脂肪氧化酶基因的表達，最終降低脂肪氧化酶的含量。馬建[20]將RNA干擾技術應用于改良大豆脂肪氧化酶含量，取得了良好效果，獲得了脂肪氧化酶含量明顯降低、脂肪含量明顯提高的轉基因大豆植株，克服了常規育種易受種質資源限制和育種時間長的缺點，實現了大豆育種方法的創新。趙艷等[21]從大豆基因組DNA中分離脂肪氧化酶-3基因啟動子片段Lox3p，其利用PLACE在線啟動子預測工具分析發現，序列中含有多種典型的種子及胚特異性表達元件，將克隆得到的Lox3p片段構建表達載體pCAM-Lox3p，并通過農桿菌介導法在大豆種子中進行瞬時表達，GUS組織化學染色和熒光測定都顯示，Lox3p驅動GUS基因表達的強度高于CaMV35S啟動子，結果表明，Lox3p啟動子片段具備一定的胚特異表達特性。王丹等[22]應用RNA干擾技術同時抑制大豆脂肪氧化酶（Lox）和胰蛋白酶抑制劑（KTi）基因的表達，改良大豆品質，培育缺失Lox和KTi的大豆新材料。

在育種方面，河北省農林科學院糧油研究所使用美國Century和日本Suzuyutaka脂肪氧化酶缺失近等基因系培育出五星1號、五星2號、五星3號、五星4號、冀豆12-2、冀豆12-3、冀豆12-2.3、冀豆12-3L、冀豆9號-3L等系列脂氧酶缺失優異品種（種質），該系列母本為當地品種，父本為美國和日本來源的脂肪氧化酶缺失種質。其中，五星4號為我國第1個脂肪氧化酶全缺失的無腥味大豆審定品種[23]。國內其他科研院所也積極開展相關方面的研究，其中，黑龍江農業科學院綏化研究所育成了綏無腥豆1號；山東省農業科學院作物研究所大豆研究室研究人員以抗病、高產、廣適的魯豆4號為母本，以美國種質Century為父本，育成了無豆腥味優質大豆魯93125-4；河南省科研人員育成中特1號、鄭優1號等。目前，國內大豆脂肪氧化酶研究已取得了不少成績，育成了一定數量品種。

2 脂肪氧化酶檢測技術和方法

脂肪氧化酶檢測技術除了常規品嘗，還有一些方法：張瑛等[24]利用脂肪氧化酶的偶聯氧化還原指示劑而顯色快速檢測植物脂肪氧化酶，該技術具有操作簡便、快速，結果直觀、準確，能進行定性和定量分析；吳培培等[25]利用紫外分光光度計和酶標儀測定脂肪氧化酶活性，同時利用控制脂肪氧化酶活性位點的緊密連鎖的分子標記Xwmc312以及功能標記 LOX16和 LOX18，采用PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳分離技術進行參試材料的LOX基因型鑒定。

3 脂肪氧化酶缺失對大豆貯藏的影響

王若蘭等[26]對8個脂肪氧化酶不同程度缺失大豆品種和1個正常大豆品種進行了40℃耐高溫存貯品質變化試驗，結果表明，脂肪氧化酶缺失品種相同的存貯時間后，其發芽率、粗脂肪含量、水溶性氮指數均高于普通品種，脂肪酸成分變化和色澤優于普通品種，脂肪酸值和過氧化值低于普通品種。由此可見，脂肪氧化酶缺失確實有利于大豆營養品質的保護，有利于延長大豆保質期。這可能是由于正常品種中存在脂肪氧化酶，能催化細胞膜中不飽和脂肪酸和脂肪酸氧化，形成脂肪酸氫過氧化物和自由基，造成細胞膜通透性增加等危害，進而對貯藏造成不利影響[27]。

4 結論與展望

供給側改革要求體現到大豆生產方面，除了要保證產量，還需要提高品質，市場對無腥大豆有較大需求。無腥大豆在育種、生產、生活、大豆精深加工產業等方面的研究具有廣闊的應用前景。脂肪氧化酶缺失品種培養和研究，作為從根本上消除豆腥味的方法，對提高大豆營養品質、改善風味、簡化精深加工程序、降低加工成本、延長貯藏期等方面具有重要意義。

目前，對大豆脂肪氧化酶遺傳規律的研究較清楚，但對具體調控作用機制及與其他性狀關系等方面不甚了解。已報道的檢測脂肪氧化酶的方法和手段、程序和操作逐漸簡化，成本逐漸下降。今后種質改良方面，應充分重視現代分子生物學和生物信息學技術，除了通過開發功能標記（標簽）或緊密連鎖分子標記進行分子標記輔助選擇育種、設計育種外，可使用RNA干擾、基因編輯技術提高育種效率。具有優良性狀的基因組編輯大豆產品已逐步從實驗室走向田間，并展現了較傳統轉基因作物更為優越的應用前景[28]。同時，不可偏廢常規雜交育種技術應用。檢測方面，可嘗試探索表觀（宏觀）性狀與脂肪氧化酶缺失關系，通過簡單的表觀性狀（甚至品嘗吃味）等標準建立，篩選脂肪氧化酶缺失品種（種質），創造更為簡單、可靠、可行、低成本的檢測篩選方法和技術。

應積極開展針對當地特定生態環境、生產條件和加工需求的具有自主知識產權的脂肪氧化酶缺失種質（品種）研究與應用，解決大豆的地區適應性較明顯帶來的直接引種造成的局限性和風險。

［1］ BRASH A R.Lipoxygenases：occurrence，functions，catalysis，and acquisition of substrate[J].Journal of Biological Chemistry，1999，274（34）：23679-23682.

［2］ FEUSSNER I，WASTERNACK C.The lipoxygenase pathway[J].Annual Review of Plant Biology，2002，53（1）：275-297.

［3］ZIMMERMAN D C，VICK B A.Lipoxygenase in Chlorella pyrenoidosa[J].Lipids，1973，8（5）：264-266.

［4］BENEYTOUT J L，ANDRIANARISON R H，RAKOTOARISOA Z，et al.Properties ofa lipoxygenase in green algae（Oscillatoria sp.）[J].Plant Physiology，1989，91（1）：367-372.

［5］扎桑，卓嘎，徐東東，等.作物脂肪氧化酶的研究進展[J].大麥與谷類科學，2015（2）：12-20.

［6］李亞璞.大豆脂肪氧化酶-Ⅲ酶聯免疫檢測試劑盒的制備及其穩定性研究[J].湖南農業科學，2015（7）：102-104.

［7］馬志民，蔣春志，楊春燕，等.非變性PAGE在鑒定大豆脂肪氧化酶類型中的應用[J].華北農學報，2007，22（3）：5-8.

［8］ SESSA D J，RACKIS J J.Lipid-derived flavors of legume protein products[J].J AmOil ChemSoci，1977，54（10）：468-473.

［9］MOREIRA M A，TAVARES S R，RAMOS V，et al.Hexanal production and TBA number reduced in soybean （Glycine max（L.）Merr）seeds lacking lipoxygenase isozymes 2 and 3[J].J Agri Food Chem，1993，41（1）：103-106.

［10］韓粉霞，丁安林，孫君明，等.大豆脂肪氧化酶同工酶全缺失種質的創新[J].遺傳學報，2005（2）：197-202.

［11］THEORELLH，HOLMAN R T，AKESON A.Crystalline lipoxidase[J].Acta ChemScand，1947，1（6）：571-576．

［12］ CHRISTOPHER J，PISTORIUS E，AXELROD B.Isolation of an isozyme of soybean lipoxygenase[J].Bichimica Et Biophysica Acta，1970，198（1）：12.

［13］丁安林，王雁，常汝鎮，等.大豆的抗營養因子及其改良[J].大豆科學，1994（1）：72-76.

［14］王文秀，楊春燕，張孟臣.大豆脂肪氧化酶的遺傳規律[J].河北農業大學學報，2001，24（3）：17-21.

［15］NISHIBAY，FURUTAS.Hexanal accumulation and DETBA value in homogenate of soybean seeds lacking two or three lipoxygenase isoenzymes[J].J Agric Food Chem，1995，43（3）：738-741.

［16］ NISHIBA Y，SUDA I.Degradation of vitamin E，vitamin C，and lutein in soybean homogenate:a comparison of normal soybean and lipoxygenase-lacking （triple-null） soybean [J].J Agric Food Chem，1998，46：3708-3712.

［17］傅翠真，徐文英，常汝鎮，等.中國大豆脂肪氧化酶類型鑒定及酶活性分析[J].華北農學報，1996，11（1）：25-29.

［18］麻浩，官春云.大豆脂肪氧化酶生理作用研究進展[J].大豆科學，1999（1）：62-66.

［19］劉藝苓.大豆脂肪氧化酶基因RNAi種子特異表達載體的構建[D].長春：吉林農業大學，2008.

［20］馬建.大豆脂肪氧化酶基因RNAi表達載體的構建及表達調控的研究[D].長春：吉林農業大學，2008.

［21］趙艷，史巖玲，錢丹丹.大豆脂肪氧化酶-3基因（Lox3）啟動子的克隆及其瞬時表達分析[J].生物技術通報，2010（9）：65-69.

［22］王丹，付永平，王丕武，等.大豆胰蛋白酶抑制劑和脂肪氧化酶基因雙價RNAi表達載體的改造及轉化[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2012，40（12）：85-89.

［23］張孟臣，張磊，劉學義，等.黃淮海大豆改良種質[M].北京：中國農業出版社，2014：53.

［24］張瑛，張磊，吳敬德，等.植物脂肪氧化酶同功酶快速檢測技術在無豆腥味大豆育種上的應用研究 [J].大豆科學，2003，22（1）：50-53.

［25］吳培培，宋雙.黃淮麥區部分小麥種質脂肪氧化酶活性分析及等位基因檢測[J].中國農業科學，2015，48（2）：207-214.

［26］王若蘭，李浩杰，孫中磊，等.Lox酶缺失大豆新品種耐儲藏特性的研究[J].糧食儲藏，2008（3）：34-38.

［27］左進華，董海洲.大豆脂肪氧化酶研究現狀 [J].糧食與油脂，2007（9）：1-3.

［28］沈平章，秋艷楊，立桃，等.基因組編輯技術及其安全管理[J].中國農業科學，2017，50（8）：1361-1369.