2株芽孢桿菌生物學特性研究及菌種鑒定

陳雅茜 ，樊 溢 ，Saad Abdelrahman，王景雪

（1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.新英格蘭大學環境與農業學院，澳大利亞 阿米代爾 2350）

芽孢桿菌屬（Bacillus）是一類非致病的對機體無害的好氧細菌，生長繁殖快，對消化道環境有較強的適應力，在一定條件下產生芽孢，由于芽孢的特殊結構使芽孢桿菌耐酸堿、耐高溫和耐擠壓，具有穩定性好、抗性強、復活性高等優勢[1]，在腸道酸性環境中可以穩定生存，是國家允許使用的飼料微生物菌種，并可分泌較強活性的蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶等多種活性物質[2]。鄺哲師等[3]研究發現，斷奶仔豬飼養14 d后，添加芽孢桿菌制劑的試驗組比對照組胃蛋白酶活性提高58.68%，胰淀粉酶活性提高24.05%，回腸內蛋白酶和淀粉酶活性分別提高61%和20.3%，差異均顯著（P＜0.05）。陳連民等[4]研究發現，日糧添加巨大芽孢桿菌1259可以有效地改善產蛋中后期蛋雞生產性能及蛋品質。大量研究表明，將單一飼用微生態制劑及復合產品添加到家畜飼料中，具有減少和替代飼用抗生素的作用[5-10]。

堿性蛋白酶（alkaline protease）被廣泛應用于洗滌劑、食品、絲綢、制革等行業，是目前市場上流行的洗滌添加劑，能大幅度提高洗滌去污能力。除了用于洗滌添加劑外，在21世紀初有人研究過蛋白酶脫毛，利用堿性蛋白酶處理羊毛也成為國內外研究熱點。郝建華[11]對一種新型海洋堿性蛋白酶的部分性質及其在水解羊毛方面做了初步研究，結果表明，其具有良好的處理羊毛特性及發展潛力。由于微生物蛋白酶均為胞外酶，與動植物源蛋白酶相比具有易培養、產量高、成本低、生產快速、處理相對簡單等優點，易于實現大規模生產，而且堿性蛋白酶比中性蛋白酶具有更強的水解能力和耐堿能力，因此，堿性蛋白酶的研究成為蛋白酶研究的熱點[12-14]。由于堿性蛋白酶需求量大，能產生可觀的經濟效益，因此，篩選能產生堿性蛋白酶的新型菌株、通過適當物理或化學手段提高產酶量和研究堿性蛋白酶的酶學性質一直是研究的熱點。

本試驗首先通過常規細菌分離純化方法將10株芽孢桿菌分離開，篩選出2株耐酸、耐膽鹽、能產生纖維素酶和蛋白酶的菌株，并測定其產蛋白酶的能力大小，通過微生物常規生理生化檢測結合分子生物學手段，鑒定出1株為短小芽孢桿菌，1株為Bacillus gobiens。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株為從發酵食物中分離得到的10株芽孢桿菌。

基礎培養基為LB培養基、發酵培養基、產纖維素酶培養基和產蛋白酶培養基[14]。

1.2 方法

1.2.1 芽孢桿菌的分離純化及形態觀察 將來自發酵食物中的10株芽孢桿菌混合菌液接種到LB液體培養基中，37℃，180 r/min置于恒溫搖床培養24～36 h，取1 mL富集后的菌液用無菌生理鹽水作梯度稀釋，取100 μL 10-6菌液均勻涂布在LB固體培養基上，倒置于37℃恒溫培養箱內培養24 h，挑取不同菌落形態單菌落平板劃線分離培養，重復3～4次，可得純化的菌株并編號。觀察各菌株菌落形態，革蘭氏染色并鏡檢，挑取各菌株分別接種于LB液體培養基內擴大培養24 h，用于后續試驗。

1.2.2 芽孢桿菌的耐酸性試驗 在LB液體培養基中加入HCl至pH值為2.0，按0.5%接菌量分別接入純化后的各菌株，培養條件為37℃，180 r/min；未加HCl處理的培養基在同樣的條件下培養，作為對照。分別取酸處理1，2 h的菌液以及對照組菌液用無菌生理鹽水稀釋至10-5，10-6，10-7濃度，每個梯度吸100 μL均勻涂布平板，重復3個平板，最后進行平板菌落計數并算出平均數，計算存活率。

其中，C1為不同濃度菌液在酸處理不同時間的活菌平均數；C0為未做酸處理的菌液在對應濃度及時間的活菌平均數；K為芽孢桿菌的存活率。

1.2.3 芽孢桿菌的耐膽鹽試驗 在LB液體培養基中加入豬膽鹽至濃度為0.3%，培養條件同1.2.2；未加豬膽鹽的培養基在同樣的條件下培養，作為對照。分別取膽鹽處理1，2 h的菌液以及對照組菌液用無菌生理鹽水稀釋至10-5，10-6，10-7濃度，每個梯度吸100 μL均勻涂布平板，重復3個平板，最后進行平板菌落計數并算出平均數，計算存活率。

其中，D1為不同濃度菌液在膽鹽處理不同時間的活菌平均數；D0為未做膽鹽處理的菌液在對應濃度及時間的活菌平均數。

1.2.4 芽孢桿菌的產纖維素酶能力試驗 用滅菌接種環挑取斜面保存的篩選菌株點種于產纖維素酶平板中，于37℃恒溫培養箱中培養72 h。在培養好的產纖維素酶平板中加入2 mL0.2%剛果紅水溶液顯色30 min，倒出顯色液，加入3 mL1 mol/LNaCl洗脫液15 min，觀察菌落周圍是否出現水解圈。

1.2.5 芽孢桿菌的產蛋白酶能力試驗 用滅菌接種環挑取斜面保存的篩選菌株點種于產蛋白酶平板中，于37℃恒溫培養箱中培養72 h。在產蛋白酶平板上直接觀察是否有透明水解圈出現。

1.2.6 酪氨酸標準曲線的繪制 參照中華人民共和國國家標準GB/T 23527—2009標準曲線繪制方法繪制。

1.2.7 樣品蛋白酶活的測定 在300 mL發酵培養基中按1%接種量分別接種513-A和513-O，180 r/min，37℃培養24 h后離心，收集上清液并分別加入30%（NH4）2SO4固體攪拌，4 h后8 000 r/min冷凍離心，在上清液中緩慢加入70%（NH4）2SO4固體，邊加邊攪拌，整個過程都在冰浴上進行，4℃過夜后冷凍離心，沉淀用10 mL PBS緩沖液溶解，透析，4 h換一次蒸餾水，用AgNO3檢測直到沒有白色沉淀為止，制成的粗酶液用于后續酶活測定。蛋白酶活力測定參照國家標準GB/T 23527—2009中的樣品測定方法測定并計算酶活力大小。

1.2.8 菌株生理生化特征鑒定 生理生化試驗參照《常見細菌系統鑒定手冊》[15]和《伯杰細菌鑒定手冊》[16]，對513-A和513-O分別進行MR試驗、VP試驗、接觸酶試驗、糖發酵試驗、丙二酸鹽利用、檸檬酸鹽利用、滲透壓試驗、硝酸鹽還原試驗、亞硝酸鹽還原試驗、明膠液化、酯酶試驗。

1.2.9 分子生物學鑒定 細菌總DNA的提取按Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒操作。以提取的DNA為模板，PCR擴增引物為16S rDNA細菌通用引物，正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′，反向引物為 1429R：5′-GGTTACCTT GTTACGACTT-3′。擴增條件為 94℃ 4 min；94℃45 s，55℃45 s，72℃1 min，30 個循環；72℃10 min，4℃終止反應。PCR純化產物由上海生工生物工程有限公司測序。根據16SrDNA測序結果，在NCBI GenBank中進行BLAST檢索，再利用MEGA 7.0軟件進行多序列匹配排列，采用Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離和菌落形態觀察

將10株待測菌經過革蘭氏染色并鏡檢，最終確定 K1，K2，K3，513-A，K8，513-O，K10，K11，K12，K13號菌株為革蘭氏陽性菌，呈直桿菌，芽孢近中生或端生，均為芽孢桿菌，觀察到的桿菌菌落形態描述列于表1；其中，513-A和513-O菌落形態和顯微結構如圖1所示。

表1 10株芽孢桿菌菌落形態

2.2 耐酸性試驗結果

由圖2可知，10株芽孢桿菌中，最耐酸的是513-A菌株，pH值為2.0的酸處理1 h的存活率在70%左右，處理2 h的存活率也在50%以上；較耐酸的是513-O菌株，pH值為2.0的酸處理1，2 h的存活率都在50%以上；不耐酸的是K1，K2菌株，存活率分別為3.03%和0.77%。因此，篩選出513-A和513-O為2株耐酸芽孢桿菌。

2.3 耐膽鹽試驗結果

由圖3可知，這10株芽孢桿菌中，最耐膽鹽的是513-O菌株，0.3%膽鹽處理1 h的存活率在87%左右，處理2 h的存活率在70%左右；較耐膽鹽的是513-A菌株，0.3%膽鹽處理1 h的存活率接近70%，處理2 h的存活率在60%左右；不耐膽鹽的是K1，K10菌株，存活率分別在1%和10%左右；因此，篩選出513-A和513-O菌株為耐膽鹽芽孢桿菌，再結合耐酸試驗結果，最終確定513-A和513-O菌株作為后續試驗的菌種。

2.4 產酶能力試驗結果

2.4.1 產纖維素酶定向分析 按照1.2.4的步驟進行試驗所得結果如圖4所示。從圖4可以看出，513-A和513-O菌株周圍均出現了透明圈，說明513-A和513-O菌株均有產生纖維素酶的能力，但能力大小不同。測量水解圈直徑可知，513-A菌株產纖維素酶能力要大于513-O菌株（圖5）。

2.4.2 產蛋白酶定向分析 按照1.2.4的步驟進行試驗所得結果如圖6所示。從圖6可以看出，513-A和513-O菌株周圍均出現了水解圈，說明513-A和513-O菌株均有產生蛋白酶的能力，但能力大小不同。測量水解圈直徑可知，513-O菌株產蛋白酶能力要大于513-A菌株（圖7）。

2.5 蛋白酶活力大小測定結果

2.5.1 酪氨酸標準曲線的繪制 以酪氨酸為標準品，根據酪氨酸不同含量所對應的不同吸光度值繪制標準曲線（y為吸光度值，x為酪氨酸含量），如圖8所示。所得標準曲線回歸方程為：y＝0.009 7x－0.005 1，R2＝0.999 3。

2.5.2 菌株蛋白酶活大小測定結果 按照1.2.7的方法進行試驗所得結果如圖9所示。

由圖9可知，513-A和513-O菌株均無酸性蛋白酶活性；513-O菌株的中性蛋白酶和堿性蛋白酶活力均高于513-A菌株，分別為56.52，65.72 U/mL，且513-O菌株的堿性蛋白酶活力最大。

2.6 513-A和513-O菌株生理生化特征鑒定

513-A和513-O菌株生理生化特征列于表2，并參考《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行鑒別。

表2 513-A和513-O菌株生理生化特征

2.7 分子生物學鑒定

分別以513-A和513-O這2個菌株細菌DNA為模板，16SrDNA通用引物進行PCR擴增，獲得了2條長度分別為1 426，1 441 bp的PCR產物；系統進化樹構建結果如圖10，11所示。

由圖10可知，菌株513-A和短小芽孢桿菌遺傳距離最小，親緣關系最近，測序結果顯示，513-A菌株與短小芽孢桿菌（KC771051.1）特異性序列同源性達到99%，且513-A菌株與短小芽孢桿菌生理生化特征十分相似，判定513-A菌株為短小芽孢桿菌。

由圖11可知，菌株513-O與Bacillus gobiensis遺傳距離最小，親緣關系最近，測序結果顯示，513-O 與 Bacillus gobiensis（NZ CP012600.1）特異性序列同源性達到99%，因此，推斷513-O菌株為Bacillus gobiensis。

3 討論

傳統的細菌分類鑒定方法如菌落形態觀察和革蘭氏染色等，存在判斷粗略、誤差大等缺點，無法滿足現代細菌學研究的發展要求。隨著分子生物學的發展，16S rDNA成為細菌系統分類研究中最常用和最有效的分子指標[17]，因為其種類少，含量大，分子大小適中，約1.5 kb左右，在結構與功能上具有高度的保守性，既能體現不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術較容易得到其序列。一般認為，16SrDNA序列同源性大于99%，可認為屬于同一種；同源性為95%～98%可認為是同屬不同種；同源性在95%以下可認為不同屬[18-19]。本試驗中對513-A和513-O的DNA進行PCR擴增得到的產物片段大小分別為1 426，1 441 bp，具有典型的16S rDNA特征。在GenBank中進行序列比對發現，513-A菌株與短小芽孢桿菌特異性序列同源性達到99%，并且其菌落形態和生理生化特性與短小芽孢桿菌基本一致，因而，可認為513-A菌株為短小芽孢桿菌；513-O菌株與Bacillus gobiensis特異性序列同源性達到99%，說明屬于同一種，再結合系統進化樹可知，與Bacillus gobiensis親緣關系最近，故初步推斷513-O菌株為Bacillus gobiensis。除了16S，其他保守基因或者種的特有基因，以及多種分子生物學手段都能為菌種的鑒定提供一定證據。

由于動物體內環境十分復雜，如胃液的酸性環境、腸道的膽鹽環境以及酶分解的作用等都是影響益生菌存活率的重要因素，因此，1株優良的益生菌必須具備一定的耐酸性和耐膽鹽性[20-21]。芽孢桿菌能分泌促進動物機體消化營養物質的酶類，如淀粉酶、蛋白質酶、纖維素酶等，從而提高動物對有機飼料的吸收利用率。本試驗中篩選出的513-A和513-O菌株在pH值為2.0的酸性和0.3%膽鹽環境中能保持較高的存活率，具有較強的耐酸和耐膽鹽能力，這是其可作為飼料添加劑的前提；通過產酶定性試驗得出，513-A菌株產纖維素酶能力優于513-O菌株，意味著513-A菌株有較強的消化纖維素的能力；513-O菌株產蛋白酶能力優于513-A菌株，意味著513-O菌株有較強消化蛋白的能力，因此，2個菌株均具有作為益生菌候選菌種的潛力。此外有研究表明，微生物飼料添加劑具有維護動物腸道健康、緩解不良應激、改善畜舍環境及凈化水質[22]、調節機體脂肪代謝和改善畜產品品質等功能[23]。

目前，國內外堿性蛋白酶主要應用于洗滌及皮革等行業，90%以上洗滌劑均添加了堿性蛋白酶，且呈上升趨勢，因此，市場出現供不應求的狀況[24]。堿性蛋白酶主要存在于細菌、放線菌和真菌中，研究較多的種屬有枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜堿性芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、米曲酶、棲土曲霉、灰色鏈霉菌、費氏鏈霉菌、鐮刀菌等[25]。但我國常用于工業生產的產堿性蛋白酶菌株種類還不夠豐富，品種較為單一。本試驗中篩選出的產堿性蛋白酶菌株513-O為Bacillus gobiensis，國內外均鮮有報道，可作為產堿性蛋白酶芽孢桿菌種類的一個補充，更加完善了產酶菌株體系；并且本試驗對其生理生化特性以及產酶特性進行了初步研究，填補了該菌株在這方面研究的空白。此外，本試驗篩選出的2株菌株產堿性蛋白酶活力均不是很高，后續可通過適當的方法來提高它們的產酶能力，如改變發酵條件、誘變育種或用基因工程手段在分子水平進行定向改造等。

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