RP-HPLC法測定替比夫定片的有關物質及含量

趙婧伊，左志輝

(1. 天津市新華中學 天津300204；2. 天津市藥品檢驗研究院 天津300070)

替比夫定片用于有病毒復制證據以及有血清轉氨酶持續升高或肝組織活動性病變證據的慢性乙型肝炎的治療[1]。替比夫定片現行國家標準為 WS1-(X-077)-2010Z，在國外藥典中未見收載。試驗研究發現，有關物質檢查供試品溶液濃度較低，為0.12,mg/mL，胸腺嘧啶峰響應很小，幾乎無法檢出，該方法靈敏度較低。含量測定供試品溶液配制方法不合理，使測定結果不準確，且有機溶劑使用量較大，產生較大浪費。經方法學驗證，對有關物質濃度與含量測定供試液的配制方法進行了修訂，并將系統適用性溶液中胸腺嘧啶與替比夫定濃度均增加5倍，修訂為 0.6,μg/mL(0.1%,)和 0.6,mg/mL，提高了方法的靈敏度與準確度。本研究建立的方法將更有效控制我國替比夫定片的質量。

1 材 料

安捷倫 HP1260型高效液相色譜儀；安捷倫HP1200型高效液相色譜儀；色譜柱：YMC-Pack ODS-AQ 柱(3,mm×150,mm，3,μm)、Agilent SB-Ag柱(5,mm×250,mm，5,μm)。

乙腈為色譜純，水為去離子水。替比夫定、胸腺嘧啶對照品均由北京某制藥有限公司提供(批號分別為 H2982、H3127)，純度 100.0%,、99.8%,。替比夫定片由北京某制藥有限公司生產，批號分別為 X0593、X0587、X0584。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

用親水性十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(YMC-Pack ODS-AQ 柱，150,mm×3,mm，3,μm)；以水為流動相 A，以乙腈-水(40∶60)為流動相 B，按表 1進行梯度洗脫；柱溫為 40,℃；檢測波長為220,nm。稱取胸腺嘧啶 6,mg，置 100,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)溶解并稀釋至刻度，搖勻，量取1,mL置100,mL量瓶中，加替比夫定60,mg，加乙腈-水(5∶100)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統適用性溶液。取 10,μL注入液相色譜儀，調節流速使替比夫定峰的保留時間約為 9,min，胸腺嘧啶峰與替比夫定峰的相對保留時間為0.7。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制備

2.2.1 含量測定供試品溶液的制備

取本品 10片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當于替比夫定 120,mg)，置 100,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)適量，超聲 15,min使替比夫定溶解，放冷，用乙腈-水(5∶100)稀釋至刻度，搖勻，取混懸液適量，4,000,r/min離心 15,min，精密量取上清液 5,mL，置 50,mL量瓶中，用乙腈-水(5∶100)稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.2 含量測定對照品溶液的制備

精密稱取替比夫定對照品約 30,mg，置 250,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)適量，超聲使溶解，放冷，用乙腈-水(5∶100)稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.3 有關物質供試品溶液的制備

精密量取含量測定項下離心后上清液 5,mL，置10,mL量瓶中，用乙腈-水(5∶100)稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.4 有關物質對照品溶液的制備

精密量取含量測定項下的對照品溶液 5,mL置200,mL量瓶中，用乙腈-水(5∶100)稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液(0.5%,)。

2.3 線性試驗

取替比夫定對照品約 30,mg，精密稱定，置250,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)適量，超聲使之溶解、放冷，并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。分別精密量取 0.05,mL、0.10,mL、0.25,mL、0.5,mL、2.5,mL、5,mL、10,mL 置 100,mL 量瓶中，用乙腈-水(5∶100)稀釋至刻度，搖勻，分別精密取上述溶液與貯備液10,μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以替比夫定濃度 C對峰面積 A作標準曲線，在 0.06～241.8,μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，線性回歸方程為A＝32.592,C+4.672，r＝0.999,9(n＝7)。

取胸腺嘧啶對照品約 12,mg，精密稱定，置200,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)適量，超聲使溶解、放冷，稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，分別精密量取 0.5,mL、1,mL、5,mL、10,mL、20,mL，置 100,mL量瓶中，用乙腈-水(5∶100)稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取上述溶液 10,μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以胸腺嘧啶濃度C(μg/mL)對峰面積A作標準曲線，在 0.29～11.63,μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，線性回歸方程為：A＝54.568,1,C+0.541,4，r＝1.000,0(n＝5)。

2.4 精密度試驗

精密稱取替比夫定片(批號 X0584)細粉適量(約相當于替比夫定 120,mg)，共 6份，按“2.1”項方法測定，胸腺嘧啶均未檢出，其他單一最大雜質均為0.021%,，其他雜質總量均為 0.040%,。本方法的精密度較好。

2.5 重復性試驗

精密量取有關物質檢查項下的對照溶液(0.5%)10,μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，6針峰面積RSD為0.21%。結果表明，本方法重復性較好。

2.6 加樣回收率試驗

分別取替比夫定對照品 0.096,mg、0.12,mg、0.14,mg，置 100,mL量瓶中，每個濃度配制 3份，并分別加入相應量的空白輔料，加乙腈-水(5∶100)適量，超聲15,min使溶解、放冷，用乙腈-水(5∶100)稀釋至刻度，搖勻，取混懸液適量，4,000,r/min離心15,min，精密量取上清液 5,mL，置 50,mL量瓶中，用乙腈-水(5∶100)稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。分別相當于 80%,、100%,、120%,含量濃度的 3組各 3份。另取替比夫定對照品 30,mg，至 100,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)適量，超聲使溶解，放冷，并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液，按照有關物質項下色譜條件分別進樣 10,μL，測定峰面積，計算平均回收率為100.0%，RSD 為0.40(n＝9)，結果見表 2。

表2 含量測定回收率結果Tab.2 Recoveries of telbivudine content determination

2.7 靈敏度測試溶液

取對照品溶液(0.5%,)稀釋至替比夫定濃度約為0.18,μg/mL，按照含量測定項下色譜條件測定，替比夫定峰信噪比為 16，主峰面積可準確積分，以此作為靈敏度測試溶液(0.03%,)。

2.8 最低檢出限

取對照溶液(0.5%,)逐步稀釋，量取 10,μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，替比夫定與胸腺嘧啶的最小檢出限均為 0.06,μg/mL(0.01%,)。

2.9 溶液穩定性

取供試品溶液(批號 X0593)，分別放置 0,h、15,h、24,h后測定，記錄色譜圖，胸腺嘧啶均未檢出，其他單一最大雜質分別為 0.021%,、0.021%,、0.022%,；其他雜質總量分別為 0.040%,、0.037%,、0.049%。表明供試品溶液在24,h內穩定。

2.10 粗放度試驗

表3 有關物質測定結果(粗放度試驗)Tab.3 Test results of related substances(extensive degree test)

方法 1：Agilent1260型高效液相色譜儀；YMCPack ODS-AQ 柱(150,mm×3,mm，3,μm)；

方法 2：Agilent1200型高效液相色譜儀；Agilent SB-Ag柱(250,mm×4.6,mm，5,μm)。

使用2種不同型號的色譜柱測定有關物質，結果基本一致(見表3)。YMC-Pack ODS-AQ柱的性能略優于安捷倫色譜柱，故在擬定質量標準中予以列出。

3 樣品測定與結果

3.1 含量測定結果

按“2.2.1與2.2.2”項下方法制備供試品溶液與對照品溶液；照“2.1”項下的色譜條件，精密量取供試品溶液與對照品溶液各 10,μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，即得。3批樣品含量測定結果見表 4，與原國標方法結果基本一致。含量測定典型色譜圖見圖1、2。

表4 樣品含量測定結果(%)Tab.4 The results of content determination(%)

圖1 對照品溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference solution

圖2 供試品溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of test solution

3.2 有關物質測定結果

圖3 有關物質檢查-對照溶液(0.5%)色譜圖Fig.3 Chromatogram of reference solution

圖4 有關物質檢查-供試品溶液(X0584)色譜圖Fig.4 Chromatogram of test solution

圖5 有關物質檢查-流動相(溶劑)色譜圖Fig.5 Chromatogram of mobile phase

圖6 有關物質檢查-空白輔料色譜圖Fig.6 Chromatogram of blank solution

按“2.2.1與2.2.2”項下方法制備供試品溶液與對照品溶液，取靈敏度測試溶液10,μL注入液相色譜儀，主成分色譜峰的信噪比應不小于10。照含量測定項下的色譜條件，精密量取供試品溶液與對照溶液各10,μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液的色譜圖中如有與胸腺嘧啶相應的雜質峰，按外標法計算并乘以0.6的校正因子，不得超過替比夫定標示量的 0.2%，其他單個雜質不得超過替比夫定標示量的 0.1%，其他雜質總量不得超過替比夫定標示量的 0.3%，各雜質總量不得超過替比夫定標示量的0.5%。3批樣品測定結果見表 2方法 1，典型色譜圖見圖 3～7。

圖7 系統適用性試驗Fig.7 Chromatogram of system suitability solution

4 討 論

4.1 系統適用性試驗

原國家標準有關物質檢查與含量測定供試品溶液濃度一致，均為 0.12,mg/mL。按原國家標準，照含量測定項下進行系統適用性試驗，采用 Agilent SBAq柱(250,mm×5,mm，5,μm)，系統適用性溶液無法檢出胸腺嘧啶峰。改用 YMC-Pack ODS-AQ柱(150,mm×3,mm，3,μm)，胸腺嘧啶峰雖可檢出，但響應很小，靈敏度較低。經試驗，將胸腺嘧啶與替比夫定濃度均增加 5倍，修訂為 0.6,μg/mL(0.1%)和0.6,mg/mL。經粗放度試驗驗證，不同型號的 2種色譜柱均可檢出胸腺嘧啶，提高了方法的靈敏度。

4.2 有關物質供試品溶液濃度的選擇

按原國家標準方法測定替比夫定片有關物質，3批樣品均未檢出雜質。根據系統適用性試驗結果，相應地將有關物質供試品溶液濃度增加5倍，修訂為0.6,mg/mL。含量測定的供試品溶液濃度仍維持原標準濃度0.12,mg/mL不變。

4.3 含量測定供試品溶液的配制

原國家標準含量測定中規定“取本品 20片，置于已定容的 1,000,mL乙腈-水(5∶100)溶液中……”。經試驗，加入替比夫定片20片后，溶液體積會增加至 1,015,mL。原質量標準的供試品溶液配制方法不合理，對含量測定結果影響較大，且產生很大浪費。經試驗，將供試品溶液的配制方法修訂為“取本品 10片，精密稱定，研細混勻，精密稱取適量(約相當于替比夫定0.12,g)，置100,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)適量，超聲 15,min使替比夫定溶解……”。

4.4 離心與濾膜濾過的比較

供試品溶液分別采用離心與濾膜濾過，含量測定結果一致，均為 98.6%。故維持原國家標準的方法，離心后取上清液稀釋。■

［1］陳新謙. 新編藥物學[M]. 14版. 北京：人民衛生出版社，1997：424.

［2］國家食品藥品監督管理局標準[S]. (WS1-(X-077)-2010Z. 2010.

［3］李發美. 分析化學[M]. 5版. 北京：人民衛生出版社，2004：21.