梓醇對AD模型細胞中海馬神經元細胞凋亡的影響

宋沖，曹斌

（長沙醫學院，湖南 長沙 410219）

引言

谷氨酸屬于哺乳動物腦內含量最高的一類興奮性氨基酸，在人體生理活動中負責協調運動、認知等功能，當腦內谷氨酸含量過高時即可造成神經元損傷[1]。當前阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的治療中即有學者提出通過干預谷氨酸損傷神經元達到治療AD 患者的目的，本文為深入研究梓醇對海馬神經元凋亡的影響，利用大鼠制作AD 模型完成觀察。

1 材料及方法

1.1 一般材料 梓醇自上海遠慕生物科技有限公司處購得，CAS 號：2415-24-9，DMEM/F12 培養基自GIB 公司處購得，噻唑藍（MTT）、多聚賴氨酸從sigma公司購買，LDH 檢測試劑由南京建成生物工程研究所提供，流式細胞儀器為德國CELLASIC 生產，型號ONIX perfusion syste。SD 大鼠來自凱學生物科技（上海）有限公司提供。

1.2 方法

海馬神經的培養與測定：無菌條件完成海馬分離，培養基清潔后將海馬組織剪成1 mm3小塊，利用膠原酶消化40 min，膠原酶pH 值控制在6.5-7.0，濃度0.5%，溫度37℃，每10 min 完成搖晃吹打1 次，后續利用200 目鋼網完成過濾，離心10 min（轉速1000 r/min），濾取上清液后加入一定培養液制成細胞懸液，控制細胞密度保持在1×109/L，隨后以1 ml/孔接種在24 孔培養板內，接種2 d 后更換低血清培養液，24 h 后在再換為DEEM/F12 培養液，后續每2 d 更換培養液1 次，更換量為原液量的一半。

分組：取出已培養7-9 d 的海馬神經元，利用隨機數字法分為對照組、AD模型組、干預組，對照組不進行干預，AD 模型組給予0.1 mmol/l 谷氨酸，干預組再給予谷氨酸之前給予濃度為0.2、1.0、5.0 mg/l 的梓醇，完成干預0.5 h 再給予谷氨酸，培養1 d 后完成檢測觀察，對照組、AD 模型組各10 個復孔，干預組高、中、低濃度組各設5 個復孔。

神經元存活情況觀察：加入20 ul 濃度為5 g/L 的MTT，控制溫度在37℃條件下，置入孵育箱（CO2濃度控制在5%），完成4 h 孵育后取出培養液，加入150 ul二甲亞砜，避光條件下完成震蕩，使用酶標儀完成570 nm 處吸光度值的測定。

LDH 測定：收集細胞培養上清液，利用LDH 檢測試劑盒完成LDH40 nm 處吸光度值檢測。細胞凋亡：利用0.25%胰蛋白酶消化細胞，制備單細胞懸液，控制細胞密度至1×109/L，取1 ml 懸液，完成離心后撇去上層清液，再加1 ml 冷PBS，離心后再撇去上清液，使細胞懸浮于緩沖液內，加入AnnexinVFITC（10 ul）及PI（5ul），等待15 min，加入緩沖液后使用流式細胞儀完成細胞凋亡情況檢測。

1.3 觀察指標 觀察3 組細胞凋亡情況、DTH、MTT。

1.4 統計學分析 使用SPSS 23.0 軟件處理數據，（）表示計量資料，t 檢驗，%表示計數資料，χ2檢驗，P＜0.05 有統計學意義。

2 結果

從下表1 可知，AD 模型組細胞凋亡率、LDH 顯著高于對照組，MTT 顯著更低（P＜0.05），干預組內細胞凋亡率從高濃度、中等濃度、低濃度組逐次上升，MTT則從低濃度至高濃度逐次升高，LDH 從高濃度至低濃度逐次降低，高濃度組細胞凋亡率、MTT、LDH 與對照組對比無明顯差異（P＞0.05）。

3 討論

AD 是一種以慢性進行性的記憶力減退、認知功能障礙及精神行為異常為主要臨床特征的神經變性疾病，是引起癡呆的最常見原因。AD 的發病率隨年齡增長有上升趨勢，隨著全球步入老齡化社會，AD 發病人數急劇上升。AD 發病后患者隨病情進展認知能力、記憶能力、運動能力逐漸下降，最終喪失生活自理能力，為患者及社會造成嚴重負擔[2]。

在臨床治療的嘗試中，有學者利用梓醇治療本病且取得良好效果，猜測梓醇可在AD 患者治療中對其神經細胞起到一定保護作用，但具體機制尚未證實[3]。后續許多學者圍繞β-淀粉樣蛋白進行研究，發現梓醇可減輕β-淀粉蛋白誘導的細胞凋亡，初步證實梓醇在本病中的治療價值，但有關谷氨酸過量所引起神經損傷方面研究較少，本文為彌補研究空白，更全面探悉梓醇對海馬神經元凋亡的影響，利用將3 組比較的方式完成本次研究[4]。

表1 三組LDH、MTT、細胞凋亡率對比（）

表1 三組LDH、MTT、細胞凋亡率對比（）

注：與對照組比較，＊P＜0.05；與對照比較，#P＞0.05。

本次觀察中，AD 模型組在給予谷氨酸后其細胞凋亡率較對照組明顯上升，MTT 顯著下降，而LDH 顯著升高（P＜0.05），進一步驗證了谷氨酸過量對神經細胞的損傷作用。而在干預組的觀察中發現，在加入氨基酸前，通過加入不同濃密度梓醇的梓醇可達到保護海馬神經元的目的，且以濃度越大效果越佳，當濃度至5.0 mg/l 時，細胞凋亡率、MTT、LDH 與對照組比較已無顯著差異（P＞0.05）。在張曉雙[5]等人的研究中進一步指出梓醇對于血管性癡呆大鼠神經元具有一定保護作用，可提高大鼠的學習能力及記憶能力，本次研究與其研究存在一定相似性。

綜上所述，梓醇在AD 模型中可有效控制由谷氨酸過量引起的海馬神經元凋亡。