益腎補骨液高效液相色譜法特征圖譜研究

徐 云，王婷婷，肖俊美，王寶成 ，徐 建*

（1.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司 吉林省中藥標準化關鍵工程技術重點實驗室，長春 130103；2. 通藥制藥集團股份有限公司，吉林 通化 134000）

益腎補骨液由骨碎補、何首烏、茯苓、續(xù)斷、白芍、當歸等12味中藥制成。具有滋補肝腎，強壯筋骨功效。用于肝腎不足，勞傷腰痛，筋骨損傷。現(xiàn)行標準收載于部頒標準中藥成方制劑第10冊，僅有何首烏理化鑒別，何首烏、白芍薄層鑒別，無法全面表征該中藥制劑的物質(zhì)基礎和化學成分群的整體性和復雜性，難以全面的控制益腎補骨液的內(nèi)在質(zhì)量。本實驗研究建立了益腎補骨液HPLC特征圖譜，對10批益腎補骨液進行了指紋圖譜分析。益腎補骨液與組方藥味間有較好的相關性，采用該法可幫助確定色譜峰的歸屬，進一步分析益腎補骨液的化學組成及來源，為益腎補骨液的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)[1-5]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫1200高效液相色譜儀；戴安（雙三元）高效液相色譜儀；AB204-E型分析天平。1.2 試藥 甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，磷酸等其他試劑均為分析純；益腎補骨液（批號：160901、160902、160903、160904、160905、160906、160907、160908、160909、160910）均由通藥制藥股份有限公司提供；沒食子酸（批號：110831-200302 ）、 2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批號：110844-201512 ）、芍藥苷對照品（批號110736-201438）、柚皮苷對照品（批號：110722-201111 ）、綠原酸 （批號：110753-201314 ）均由中國食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[6-9]色譜柱：ACE C18色譜柱，（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：以甲醇為流動相A，以0.02%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～ 40 min，5%A → 40%A，40～ 50 min，40%A → 40%A，50～ 51 min，40%A → 5%A，51～60 min，5%A→5%A；）流速為1 mL/min；檢測波長為230 nm；柱溫為35 ℃，進樣量：5 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液制備 取沒食子酸、芍藥苷、綠原酸、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL分別含0.1 mg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品，精密量取15 mL，加水至30 mL。用乙醚振搖提取2次，30 mL/次，棄去乙醚液，水液用水飽和正丁醇振搖提取3次，30 mL/次，合并正丁醇液，再用正丁醇飽和水洗2次，20 mL/次，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇溶解定容至10 mL量瓶中，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一份供試品溶液連續(xù)進樣6次，以芍藥苷為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間，計算結果RSD值均小于2.0%。結果表明，該儀器測試精度良好。

2.3.2 重復性試驗 取同一批（批號：160901）益腎補骨液6份，分別按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，記錄色譜圖，以芍藥苷為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間，計算結果RSD值均小于2.0%。結果表明方法的重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份益腎補骨液的供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、20 h進樣，記錄色譜圖，以芍藥苷為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間，計算結果RSD值均小于2.0%。結果表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 特征圖譜建立及相關性分析 取10批益腎補骨液成品，按上述選定的供試品溶液制備方法和檢測方法進行檢測。將10批益腎補骨液成品的測試數(shù)據(jù)導入國家藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）”軟件，采用中位數(shù)法，多點校正，自動匹配，共標定13個共有峰，并鑒定歸屬了5個特征峰；對13個特征峰進行歸屬：1號（沒食子酸）、6號、8號（芍藥苷）特征峰歸屬為白芍藥材；2號、3號、4號（綠原酸）、5號、7號、10號特征峰歸屬為續(xù)斷藥材；9號（二苯乙烯苷）特征峰歸屬為何首烏藥材；11號和13號（柚皮苷）特征峰歸屬為骨碎補藥材。10批成品特征圖譜疊加圖、生成的對照圖譜分別見圖1～圖2。

圖1 10批成品特征圖譜疊加圖

圖2 成品對照特征圖譜

3 討論

采用二級陣列檢測器，對供試品檢測波長進行了考察，考察200～400 nm全波長掃描，并重點考察在230、283、320 nm波長處的色譜圖，結合DAD三維圖及基線的波動程度、色譜峰的數(shù)目、信號響應強弱，確定230 nm 為最佳波長。考察了流動相：1）甲醇-水系統(tǒng)，線性洗脫。2）乙腈-水系統(tǒng)，線性洗脫。3）甲醇-磷酸水系統(tǒng)，非線性洗脫。流動相3）系統(tǒng)較好，并在此系統(tǒng)下進行了進一步的優(yōu)化[10-17]。益腎補骨液主要色譜峰與其組方藥味間有較好的相關性，采用該法可幫助確定藥效部色譜峰的歸屬，進一步分析益腎補骨液化學組成及來源，可為益腎補骨液的質(zhì)量控制提供理論保證。

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