水稻抗氧化酶活性測定方法的比較研究

程 艷，陳 璐，米艷華*，段紅平，茶應盛，邵金良，杜麗娟

植物在正常的生長發育過程中會產生一定量的活性氧（ROS），主要有 O－2·、H2O2、·OH、·O2等［1］。在重金屬脅迫下植物體內的 ROS會大量增加，導致植物內發生代謝紊亂［2］。植物通過不斷地提高各種抗氧化酶的活性來消除活性氧產生的不利影響，保障植物正常的生長［3－5］。因此對植物過氧化酶活性的研究，可以掌握植物應對土壤重金屬毒害的解毒應激機理，為進一步研究如何防控土壤重金屬對植物的危害提供理論依據。

在抗氧化酶系統中超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）是兩個非常重要的檢測指標。SOD的測定方法分為直接法和間接法，由于直接法所需的儀器設備價格昂貴以及SOD基質－O2－的不穩定性，一般多數采用間接法［6］。間接法分為鄰苯三酚自氧化法、細胞色素C還原法、氮藍四唑（NBT）光還原法、黃嘌呤氧化酶－NBT 法等多種方法［7－9］。 POD 的檢測方法有碘量滴定法［10］、氧電極法和比色法等方法；碘量滴定法重現性差，誤差大［11］；氧電極法需要特殊的儀器——氧電極儀，且需要標準酶液制作標準曲線，操作較繁雜。過氧化氫酶（CAT）的檢測是根據CAT催化H2O2生成O2和H20來測定其活性，測定方法有滴定法、紫外分光光度法和氧電極法［12］。

目前在國內外的研究中，測定抗氧化酶活性的方法較多，國內外還沒有統一的檢測方法。由于不同檢測方法的反應原理和酶活力單位定義不同，靈敏度和差異性較大，檢測結果差異也較大。在SOD的測定方法中，鄰苯三酚法的測定結果受pH值與鄰苯三酚濃度的影響顯著，因此用該方法測定SOD時必須嚴格控制pH，準確配制規定濃度的鄰苯三酚溶液，且在進行測定時經常出現酶液對鄰苯三酚自氧化速度的負抑制現象［13］；細胞色素C還原法被認為是間接法中的經典方法，但要求高純度的細胞色素C和黃嘌呤氧化酶；而NTB還原法沒有這些要求，靈敏度比前者約高14.7倍，已被廣泛應用于生物學和醫學研究［14－16］。 在 POD 的測定中，愈創木酚法是應用最廣泛的方法，其價格較經濟，且無需特殊的儀器。在CAT的測定中，滴定法誤差較大；氧電極法需要專門的儀器，且CAT標準酶樣品受溫度的影響較大；紫外分光光度法是最常用的方法。

本文以水稻為研究對象，利用酶檢測試劑盒與傳統檢測方法對水稻根部抗氧化酶的活性進行了檢測，以便篩選出一種便捷、結果可信度高的檢測方法，為后續檢驗測定水稻不同部位的抗氧化酶活性提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

水稻盆栽試驗在云南省農業科學院科研基地進行，采用50 cm×30 cm×40 cm的塑料盆，每盆裝土40.0 kg。本試驗設置對照組CK（不添加Na3AsO4）和試驗組 As－40（添加 40 mg／kg的 Na3AsO4）兩組試驗，分別在水稻旺長期取水稻根系進行抗氧化酶活性的檢測。

1.2 試驗材料

隨機選取5株水稻，剪取根系，洗凈泥沙，用蒸餾水沖洗3～5次，吸干多余水分；取待測樣品0.5 g，剪碎置于玻璃勻漿器，加5 mL磷酸緩沖液（0.1 mol／L，pH 7.4），冰浴研磨制成勻漿；在低溫（4℃）下離心（轉速5000 r／min）10 min，取上清液即為酶粗提液；于－4℃冷藏備用。

1.3 酶試劑盒測定法

SOD活性檢測采用總超氧化物歧化酶（T－SOD）測試盒（A001－1，羥胺法，南京建成科技有限公司）；CAT活性檢測采用過氧化氫酶（CAT）測試盒（A007－1，可見光法，南京建成科技有限公司）；POD活性檢測采用過氧化物酶（POD）測試盒（A084－3，南京建成科技有限公司）。實驗過程嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4 傳統酶檢測法

采用李合生的方法［17］，并加以改進。

SOD活性采用氮藍四唑（NBT）光還原法檢測：取酶液100μL，加入3.4 mL反應混合液和0.3 mL 20 μmol／L核黃素溶液，混勻，以不加酶液為對照，對照管罩黑色硬紙遮光；將測定管與對照管同時置于4000 lx燈下反應 20～30 min，于 560 nm處測定OD值。

POD活性采用愈創木酚比色法檢測：取分光光度計比色杯（半徑1 cm），加入反應液（含0.1 mol／L pH 6.0的磷酸緩沖液5 mL、愈創木酚28μL、30%H2O219μL）和1 mL酶液，以不加酶液為對照，混勻，立即計時，測定470 nm處的OD值，每隔1 min讀數1次。

CAT活性采用紫外分光光度法檢測：取酶液100 μL，加入 2.9 mL 反應液（20 mmol／L H2O2溶液），混勻。以蒸餾水為空白對照，在反應15 s后開始記錄反應體系于240 nm處的OD值，即為初始值；然后每隔30 s記錄1次，至少測定6個點的OD值，重復3次。

1.5 統計分析

采用SPSS 19.0統計分析軟件和Microsoft Excel 2010對實驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 水稻根部SOD、CAT和POD活性測定分析

從圖1中可以看出：用傳統方法測定的水稻根部SOD的活性略高于用酶試劑盒法測定的結果，且SOD活性表現為As－40＞CK，但差異不大；用傳統方法測定的CAT活性也高于用試劑盒法的檢出值，但兩者間無顯著差異；用兩種方法檢測的POD活性值幾乎一致。

圖1 用兩種方法測定的抗氧化酶活性

2.1.1 SOD檢測方法的比較 采用酶試劑盒法測定樣品的SOD活性并以變異系數對其精確度進行比較，表1顯示酶試劑盒測定結果的變異系數均小于3%，說明酶試劑盒測定結果精確性好。在相同條件下，采用傳統方法測定樣品的SOD活性，其變異系數均大于酶試劑盒測定的結果，故在SOD活性檢測中，酶試劑盒法優于傳統方法。

2.1.2 CAT活性測定方法的比較 采用兩種方法測定樣品的CAT活性并以變異系數對其精確度進行比較。從表2可以看出，酶試劑盒法所測結果的變異系數均小于傳統方法所測結果的，說明酶試劑盒測定結果的精確性優于傳統方法的。這可能是由于傳統方法的操作工序較為繁雜，每個環節都可能影響檢測結果的穩定性。故在CAT活性檢測中，采用酶試劑盒法檢測優于傳統方法檢測。

表1 SOD活性測定結果的變異系數

表2 CAT活性測定結果的變異系數

2.1.3 POD活性測定方法的比較 采用兩種方法測定樣品的POD活性并以變異系數對其精確度進行比較。從表3可知，酶試劑盒法所測結果的變異系數均小于傳統方法的。這是因為用傳統方法測定時需要進行等時段的連續測定，增加了檢測的難度，降低了檢出值的準確度。因此，POD酶試劑盒優化了操作過程，使測定結果更穩定更準確。

表3 POD活性測定結果的變異系數

2.2 抗氧化酶活性測定方法的差異顯著性比較

對兩種方法測定的結果進行差異顯著性比較，結果見表4。從表4可以看出，3個檢測項目的P值均大于0.05，說明用2種方法測得的結果都無顯著性差異。

表4 抗氧化酶活性測定結果的差異顯著性

2.3 抗氧化酶活性測定結果的相關性

以傳統方法測得的數據為自變量x，以試劑盒法測得的數據為因變量y，對兩種方法進行相關性分析，結果見表5。表5的結果表明，用傳統檢測方法和酶試劑盒法檢測的SOD、CAT、POD活性間的相關系數都達到了1，因此可以認為兩種方法測得的3種酶活性基本相同。

2.4 抗氧化酶活性測定方法的靈敏度比較

對兩種方法的進樣量進行比較，結果見表6。由表6可知：在SOD活性檢測中，傳統檢測方法的進樣量是酶測定試劑盒法的1.82倍；在CAT活性測定中，酶測定試劑盒法的進樣量僅為5μL，而傳統檢測方法的進樣量為其20倍；在POD活性測定中，傳統檢測方法的進樣量為酶試劑盒法的10倍。可見，酶試劑盒法測定的靈敏度遠高于傳統檢測法的。

表5 抗氧化酶活性測定結果的相關性分析結果

表6 兩種抗氧化酶活性測定方法的進樣量比較

酶試劑盒法測得結果的變異系數小于傳統檢測方法的，且用兩種方法測定的結果無顯著性差異。綜上所述，在測定水稻根系SOD、CAT、POD活性時，酶測定試劑盒法的測定結果可信度高，且操作簡便。

3 討論與結論

本研究結果表明：在砷脅迫下，水稻根部SOD、CAT活性受到抑制，這與楊桂娣等［18］的研究結果一致；而POD活性較對照升高，這與趙天宏等［19］的研究結果一致。在測定水稻根部SOD、CAT、POD活性時，酶測定試劑盒法和傳統檢測方法都可以采用，且兩種方法的檢測結果無顯著差異。但從精確度方面考慮，采用酶測定試劑盒法較好。從操作方面考慮，兩種方法均可采用pH 7.4的緩沖液提取3種酶，對其活性影響不大［20］。在SOD活性檢測中，傳統檢測方法需在試劑加完并混勻后，在4000 lx燈下反應20～30 min；而酶檢測試劑盒法只需在室溫下放置10 min，節省了檢測時間。在CAT活性檢測中，傳統檢測方法需在反應15 s時記錄其在240 nm處的OD值作為初始值，然后每隔30 s記錄1次，至少獲得6個點的數據，并重復3次，在結果計算中，經常由于反應時間的取值范圍不準確而導致結果錯誤［21］；而酶檢測試劑盒法則不需進行此操作。在POD活性檢測中，傳統檢測方法需在反應液與酶液混勻后，立即開始計時，每隔1 min記錄1次在470 nm處的OD值；但采用酶檢測試劑盒法進行檢測時只需將酶液與反應液混勻后離心（3500 r／min，10 min）即可。 可見，與傳統檢測方法相比，采用酶檢測試劑盒法測定水稻根部 SOD、CAT、POD活性具有操作簡便、快速的優點。

由于不同方法的反應原理和酶活性單位的定義不同，且從原料中得到的粗提物酶活力一般較低［22］，因此不同檢測方法的靈敏度差異較大。以相同取樣量采用傳統檢測方法測定不同樣品的酶活性，會出現抑制率變化甚至難以測出其酶活性的情況。因此，從靈敏度方面考慮，酶試劑盒法測定酶活性優于傳統檢測方法。

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