萬載龍牙百合主要病毒的檢測及其檢測技術的建立

謝晚彬，丁永電

龍牙百合（Lilium brownii var.viridulum）是久負盛名的萬載地方特產，萬載以龍牙百合種植為主，江西萬載、永豐和湖南隆回并稱為全國三大龍牙百合產地。龍牙百合富含淀粉、脂肪、蛋白質、維生素等營養成分，以及秋水仙堿、秋水仙胺等具有抑制細胞分裂的藥物成分，因而龍牙百合具有很高的營養價值，同時其在癌癥的防控上展現出良好的藥用價值［1］。百合一般通過種球、株芽等無性方式進行繁殖，在繁殖過程中，一旦發生病毒感染，病毒便會在植株體內生長，進而在植株之間傳播，造成百合產量降低，品質下降。侵染百合的主要病毒有黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）、百合斑駁病毒（Lily mottle virus，LMoV）和百合無癥病毒（Lily symptomless virus，LSV），這 3種病毒發生最普遍，危害最嚴重［2－4］。在百合生產種植過程中，脫毒苗的應用是防控病毒病的根本措施，而可靠的病毒檢測技術是確保脫毒苗真正無毒的保證。因此，建立一種針對萬載龍牙百合主要病毒的檢測技術，確保脫毒苗真正無毒，對其病毒病的防控具有重要意義。

目前百合病毒的檢測方法主要有電鏡檢測法、指示植物法、酶聯免疫法和反轉錄聚合酶鏈式反應（Reverse transcription－polymerase chain reaction， RTPCR）法等［5－7］。RT－PCR 法以百合病毒的 RNA 為模板，通過反轉錄和聚合酶鏈式反應對RNA進行擴增，根據擴增產物的有無即可檢測出病毒的有無，因此與電鏡檢測法、指示植物法、酶聯免疫法相比，RT－PCR法具有快速、靈敏、特異性強、操作簡單等優點。目前，關于采用RT－PCR法檢測萬載龍牙百合主要病毒的研究尚未見報道。因此，我們以萬載龍牙百合為試驗材料，研究了檢測其主要病毒的RT－PCR技術，以期為百合病毒病的防控、脫毒苗的無毒化生產提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試百合

供試百合為龍牙百合，采用五點取樣法從萬載縣白水鄉發病田塊取樣得到。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit， Code No.9769）、RT－PCR 試劑盒（TaKaRa PrimeScriptTMOne Step RT－PCR Kit Ver.2，Code No.RR055A）、DNA Marker（2000）均購自日本Takara公司。

引物 CMVF／CMVR、LMoVF／LMoVR、LSVF／LSVR、18SF／18SR由上海生工生物工程有限公司合成，它們的序列參見表1。

表1 試驗所用引物

1.3 主要儀器

5804R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）、PEARL微量核酸蛋白分析儀（德國Implen公司）、TP600 PCR儀（日本Takara公司）、DYY－8C電泳儀（北京市六一儀器廠）、TANON－2500電泳凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）。

1.4 龍牙百合鱗莖組織的裂解

龍牙百合鱗莖組織的裂解操作步驟如下：（1）將適量新鮮的龍牙百合鱗莖組織置于液氮預冷的研缽中，用研磨杵研磨鱗莖組織，在研磨過程中不斷加入液氮，直至將鱗莖組織徹底研磨成粉末狀；（2）將50 mg龍牙百合鱗莖組織粉末狀樣品置于1.5 mL滅菌離心管中，加入450μL Buffer PE，用移液器吹打混勻，使樣品充分裂解，直至無明顯沉淀，然后將裂解液在 4 ℃下以 12000 r／min離心5 min；（3）將上清液置于1個新的1.5 mL滅菌離心管中，加入45μL Buffer NB，混勻，4 ℃、12000 r／min 離心 5 min；（4）再將上清液置于1個新的1.5 mL滅菌離心管中，加入450μL Buffer RL，混勻，混合液用于總RNA的提取。

1.5 龍牙百合總RNA的提取

龍牙百合總RNA的提取操作步驟如下：（1）往上述混合液中加入250μL無水乙醇，混勻后立即置于 RNA Spin Column中（分 2 次），以 12000 r／min離心1 min，棄濾液；（2）往 RNA Spin Column中加入500 μL Buffer RWA，以 12000 r／min 離心 30 s，棄濾液；（3）往 RNA Spin Column中加入 600 μL Buffer RWB，以 12000 r／min 離心 30 s，棄濾液。 用 Buffer RWB洗滌2次；（4）將 RNA Spin Column以 12000 r／min離心2 min，除去殘留液體；（5）將RNA Spin Column置于1.5 mL RNase Free的收集管中，然后在RNA Spin Column膜中央處加入50μL RNase Free dH2O，室溫靜置5 min 后，以12000 r／min 離心2 min，收集管中收集的濾液即為總RNA提取液。

用PEARL微量核酸蛋白分析儀對總RNA提取液進行濃度和純度檢測，檢測其是否符合進行RTPCR的質量要求。

1.6 主要病毒的檢測及檢測技術的建立

通過RT－PCR法進行龍牙百合主要病毒的檢測。 采用引物 CMVF／CMVR、LMoVF／LMoVR、LSVF／LSVR、18SF／18SR從總 RNA提取液中分別擴增CMV、LMoV、LSV等主要病毒和18S rRNA分子。根據RT－PCR試劑盒操作說明，設定RT－PCR反應體系為：2×RT－PCR Buffer 5 μL、RNase－free dH2O 3 μL、總 RNA 提取液1 μL、Forward Prime（10 μmol／L）0.4 μL、Reverse Prime （10 μmol／L） 0.4 μL、RT－PCR polymerase 0.2μL。根據引物的Tm值，并參考相關文獻報道［8］，設定RT－PCR 的反應條件為：50℃逆轉錄30 min；94℃預變性 5 min；94℃變性 30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環；72℃最后延伸7 min。取出RT－PCR產物，進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳。

若電泳結果顯示擴增出病毒的特異片段，則表明萬載龍牙百合感染了該病毒，同時根據相應的RTPCR反應條件，可以建立該病毒的RT－PCR檢測技術。若電泳結果顯示沒有擴增出病毒的特異片段，則將退火溫度逐漸降低，先后設定為55℃、50℃，重復上述RT－PCR檢測過程。

2 結果與分析

2.1 龍牙百合總RNA的提取

采用總RNA提取試劑盒從龍牙百合鱗莖組織提取總RNA，用PEARL微量核酸蛋白分析儀檢測總RNA提取液的濃度和純度，檢測結果顯示：總RNA提取液的濃度為 74.449 ng／μL，符合進行 RT－PCR的要求；總 RNA提取液的 A260值為1.861，A280值為0.918，A260／A280值為 2.027，接近 2.0，表明純度高，也符合進行RT－PCR的要求。

2.2 主要病毒的檢測及檢測技術的建立

采用引物 CMVF／CMVR、LMoVF／LMoVR、LSVF／LSVR、18SF／18SR從總 RNA提取液中分別擴增CMV、LMoV、LSV等主要病毒和18SrRNA分子（RTPCR的退火溫度設定為60℃），對RT－PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果圖1第2泳道顯示從總RNA提取液中擴增出LMoV病毒的特異片段（623 bp）；圖1第1泳道和第3泳道分別顯示從總RNA提取液中沒有擴增出CMV和LSV病毒的特異片段。LMoV病毒的RT－PCR檢測技術（條件）為：50℃逆轉錄30 min；94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環；72℃最后延伸7 min。

將退火溫度降低為55℃，第2次擴增CMV和LSV病毒，并對RT－PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果圖2第1泳道和第2泳道分別表明：從總RNA提取液中也沒有擴增出CMV病毒的特異片段（255 bp）和LSV病毒的特異片段（439 bp）。

將退火溫度降低為50℃，第3次擴增CMV和LSV病毒，并對RT－PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，圖3第1泳道和第2泳道分別顯示：從總RNA提取液中還是沒有擴增出CMV病毒的特異片段（255 bp）和LSV病毒的特異片段（439 bp）。

圖1 龍牙百合主要病毒的RT－PCR檢測

圖2 龍牙百合CMV和LSV病毒的RT－PCR檢測

3 討論與結論

我們在龍牙百合CMV、LMoV、LSV等主要病毒的RT－PCR檢測過程中，根據引物的Tm值，并參考相關文獻報道［8］，將 RT－PCR的退火溫度設定為 60℃，順利擴增出LMoV病毒的特異片段（623 bp）（圖1第2泳道），但未能擴增出CMV病毒的特異片段（圖1第1泳道）和LSV病毒的特異片段（圖1第3泳道）。為此我們將CMV和LSV病毒檢測的退火溫度下調至55℃，均只在1000～2000 bp之間擴增出1條DNA片段（圖2），與CMV病毒的特異片段（255 bp）和LSV病毒的特異片段（439 bp）長度不符。當將CMV和LSV病毒檢測的退火溫度進一步下調至50℃，也均只在1000～2000 bp之間擴增出1條DNA片段（圖3）。

圖3 龍牙百合CMV和LSV病毒的RT－PCR檢測

在采用RT－PCR檢測百合病毒的文獻報道中，大多數通過RT－PCR產物中有無病毒的特異片段來判斷被檢測的百合是否感染該病毒［9－10］，這可能會因RT－PCR試劑失效和操作失誤而造成假陰性的情況。為此我們引入18SrRNA作為內參照，當RT－PCR的退火溫度設定為60℃時，順利擴增出18SrRNA的特異片段（200 bp）（圖1第4泳道），但是沒有擴增出CMV和LSV的特異片段，從而排除了因RT－PCR試劑失效和操作失誤而造成假陰性的情況。

根據以上試驗結果，可以得出：萬載龍牙百合感染了LMoV病毒，而沒有感染CMV病毒和LSV病毒。同時可以確定LMoV病毒的RT－PCR檢測技術為：50℃逆轉錄30 min；94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環；72℃最后延伸7 min。另外，本研究建立的RT－PCR檢測技術可以用于萬載龍牙百合主要病毒的檢測，對萬載龍牙百合脫毒苗的無毒化生產和病毒病的防控具有重要意義。

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