DNA甲基化抑制劑5－azaC對(duì)花椰菜生長(zhǎng)發(fā)育的影響

袁建民，木萬(wàn)福，麻繼仙，楊 龍，李易蓉，但 忠，蘇銀玲

花椰菜（Brassica oleracea L.var.botrytis L.），又稱花菜、菜花、椰菜花，包括通常所說(shuō)的青花和白花2種。青花即青花菜（Brassica oleracea var.italica），又名西蘭花、綠菜花等。花椰菜以花球?yàn)槭秤闷鞴伲瑺I(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，是我國(guó)重要的蔬菜作物之一，具有一定的防癌、抗癌功效［1］，深受消費(fèi)者的青睞。近年來(lái)，栽培面積迅速擴(kuò)大，就云南而言，年生產(chǎn)面積約3.33萬(wàn)hm2（含復(fù)種）。近年來(lái)，關(guān)于花椰菜在形態(tài)學(xué)［2］、細(xì)胞學(xué)［3］、生理生化［4］、分子水平［5］等方面的研究報(bào)道較多，并取得了一定的進(jìn)展。然而，對(duì)于表觀遺傳研究、DNA甲基化水平變化、基因表達(dá)調(diào)控等方面的研究卻比較缺乏。DNA甲基化與表觀遺傳變化密切相關(guān)，在植物的整個(gè)發(fā)育分化過(guò)程中，DNA甲基化對(duì)控制基因表達(dá)、基因組防御、生長(zhǎng)發(fā)育都起著重要作用［6］。DNA甲基化抑制劑5－氮雜胞苷（5－azaC）現(xiàn)已廣泛用于植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控等方面的研究。甲基化水平會(huì)影響植物的花期、株高、抗病性、產(chǎn)量等重要農(nóng)藝性狀，同時(shí)產(chǎn)生的一些表型變異可作為育種材料［7］。

目前，涉及的甲基化研究主要集中在擬南芥［8］、水稻［9］、小麥［10］等植物上，而關(guān)于 DNA 甲基化抑制劑在花椰菜育種上的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以花椰菜（青花和白花）為試材，對(duì)DNA甲基化抑制劑5－azaC對(duì)花椰菜生長(zhǎng)發(fā)育的影響進(jìn)行初步探索，以期通過(guò)表觀遺傳學(xué)的方法為花椰菜育種及繁種提供一定的科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步深入研究DNA甲基化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為5份不同熟性的花椰菜材料（表1）。其中，青花材料包括13195父本、13195母本及13027母本，白花材料包括C－2母本和152母本，均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所蔬菜研究中心提供。

表1 供試材料

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2014年在云南省楚雄州元謀縣熱區(qū)所蔬菜實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理，DNA甲基化抑制劑 5－azaC 濃度分別為 0、5、10、20、40 mg／L，依次記為對(duì)照（CK）、T1、T2、T3、T4。

供試材料于2014年7月20日播種育苗，穴盤采用50孔的黑色塑料盤，當(dāng)花椰菜幼苗長(zhǎng)至5片左右真葉時(shí)，選取大小均勻一致的幼苗進(jìn)行5－azaC葉面噴施處理，葉面噴施至葉片充分淋濕為止，為使溶液充分接觸葉片，在溶液中加入1～2滴吐溫20，每隔5 d處理1次，共3次。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每處理重復(fù)3次。每個(gè)小區(qū)定植20株，小區(qū)面積約4 m2，株距40 cm，行距50 cm，常規(guī)田間栽培管理。

1.3 數(shù)據(jù)調(diào)查與分析

調(diào)查不同熟性花椰菜材料的生育期和各時(shí)期的主要生物學(xué)性狀，包括株高、株幅、現(xiàn)蕾天數(shù)（從定植到現(xiàn)蕾的天數(shù)）、葉長(zhǎng)度、葉寬度、葉形指數(shù)、莖粗、葉柄長(zhǎng)、花球直徑、單球質(zhì)量等。每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取5株調(diào)查記錄并取平均值。

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的初步處理和制表，采用SAS 9.0國(guó)際通用統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析，并用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 5－azaC處理對(duì)花椰菜株高的影響

當(dāng)花椰菜生長(zhǎng)到120 d左右時(shí)，對(duì)株高進(jìn)行測(cè)量。由表2可知，不同濃度5－azac對(duì)不同花椰菜材料株高發(fā)育的影響不同。對(duì)青花材料而言，處理組對(duì)其株高的生長(zhǎng)存在顯著促進(jìn)效應(yīng)，均比對(duì)照高。當(dāng)5－azac濃度為20 mg／L時(shí)，13195父本株高達(dá)到最高；5－azac濃度為 10 mg／L時(shí)，13195母本株高達(dá)到最高；而5－azac濃度為 40 mg／L時(shí)，13027母本株高達(dá)到最高。對(duì)白花材料而言，處理組對(duì)C－2母本株高的生長(zhǎng)促進(jìn)效應(yīng)顯著高于對(duì)照，隨著5－azac濃度的升高，促進(jìn)效應(yīng)隨之降低；而對(duì)152母本株高的生長(zhǎng)存在一定程度的抑制效應(yīng)，隨著5－azac濃度的升高，抑制效應(yīng)隨之增強(qiáng)。

表2 不同濃度5－azaC處理對(duì)花椰菜株高發(fā)育的影響 cm

2.2 5－azaC處理對(duì)花椰菜株幅的影響

由表3可知，同一材料在不同濃度5－azaC處理之間花椰菜株幅存在顯著差異。隨著5－azaC濃度的升高，13195父本和152母本的株幅呈下降趨勢(shì)，表現(xiàn)為抑制效應(yīng)；而13195母本、13027母本和C－2母本的株幅變化則呈升高趨勢(shì)，表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)，表明無(wú)論是白花還是青花，不同花椰菜材料對(duì)5－azaC處理的敏感程度不同。

表3 不同濃度5－azaC處理對(duì)花椰菜株幅發(fā)育的影響 cm

2.3 5－azaC處理對(duì)花椰菜現(xiàn)蕾時(shí)間的影響

現(xiàn)蕾時(shí)間的早晚不僅與花椰菜熟性密切相關(guān)，而且還受許多外界因素的影響，現(xiàn)蕾時(shí)間的早晚直接影響著花椰菜種子的生產(chǎn)。由表4可以看出，與對(duì)照相比，青花材料13195母本，提前現(xiàn)蕾時(shí)間較短，在10 mg／L 5－azaC條件下最多可以提前 3 d左右；而13027母本在10 mg／L 5－azaC條件下提前現(xiàn)蕾時(shí)間最高可以達(dá)到8 d左右；其余13195父本、C－2母本、152母本提前現(xiàn)蕾時(shí)間最大值分別為7.0、6.4、4.3 d。此外，在5個(gè)供試材料中，13195父本和C－2母本在5－azaC濃度為20 mg／L條件下提前現(xiàn)蕾時(shí)間達(dá)到最大值；而13195母本、13027母本、152母本均在 5－azaC濃度為10 mg／L條件下提前現(xiàn)蕾時(shí)間達(dá)到最大值。由此可見(jiàn)，現(xiàn)蕾時(shí)間的早晚與5－azaC的濃度存在密切相關(guān)，提前現(xiàn)蕾的適宜5－azaC濃度為10～20 mg／L。同一材料在不同濃度5－azaC處理下，花椰菜現(xiàn)蕾時(shí)間存在顯著差異。各處理的現(xiàn)蕾時(shí)間均比對(duì)照明顯提前，現(xiàn)蕾時(shí)間提前范圍為3～8 d，這表明甲基化抑制劑5－azaC可以在一定程度上促進(jìn)花椰菜提早現(xiàn)蕾提早開(kāi)花。

表4 不同濃度5－azaC處理對(duì)花椰菜現(xiàn)蕾時(shí)間的影響 d

2.4 5－azaC處理對(duì)花椰菜花球直徑的影響

當(dāng)花椰菜幼苗生長(zhǎng)到120 d左右，可見(jiàn)明顯花蕾時(shí)對(duì)花球直徑進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，結(jié)果顯示（表5）：在同一供試材料中（除了材料C－2母本），不同濃度5－azaC處理之間花椰菜花球直徑變化差異顯著。隨著5－azaC濃度的升高，13195母本的花球直徑均明顯高于對(duì)照組，而13195父本、13027母本和152母本的花球直徑與對(duì)照組相比，呈先升高后下降趨勢(shì)。當(dāng)5－azaC 濃度為 10 mg／L時(shí)（T2），所有供試材料的花球直徑均達(dá)到最大值；當(dāng)5－azaC濃度達(dá)到40 mg／L時(shí)（T4），13195父本的花球直徑受到的抑制效應(yīng)最明顯。可見(jiàn)，不同花椰菜材料花球直徑對(duì)5－azaC處理的影響程度不同。

表5 不同濃度5－azaC處理對(duì)花椰菜花球直徑的影響 cm

2.5 5－azaC處理對(duì)花椰菜單球質(zhì)量的影響

田間觀察表明，在整個(gè)生育期內(nèi)，處理組與對(duì)照組均能正常生長(zhǎng)發(fā)育，未發(fā)現(xiàn)幼苗枯萎或死亡現(xiàn)象。無(wú)論是青花還是白花，其葉形、葉色、花球顏色等農(nóng)藝性狀基本一致。單球質(zhì)量是影響花椰菜產(chǎn)量的重要指標(biāo)。結(jié)果顯示（表6）：在同一供試材料中，不同濃度5－azaC處理之間的花椰菜單球質(zhì)量變化差異顯著，而C－2母本各處理之間的差異不顯著，表明不同材料對(duì)5－azaC處理的敏感程度不同。隨著5－azaC濃度的升高，13195父本、13195母本、13027母本、152母本的單球質(zhì)量與對(duì)照相比呈先升高后下降趨勢(shì)，低濃度（低于10 mg／L）表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)，高濃度（10～40 mg／L）表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。 5－azaC 濃度為 10 mg／L 時(shí)（T2），13195 母本、13027母本和 152 母本單球產(chǎn)量達(dá)到最大值；而當(dāng)5－azaC濃度為40 mg／L時(shí)（T4），13195父本和13195母本的單球質(zhì)量與對(duì)照相比抑制效應(yīng)最明顯。

表6 不同濃度5－azaC處理對(duì)花椰菜單球質(zhì)量的影響 g

3 結(jié)論與討論

已有研究指出，DNA甲基化參與植物基因的表達(dá)調(diào)控，DNA甲基化不足或太高都可以引起植物的表型異常，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)DNA甲基化是植物正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中所必需的。DNA甲基化抑制劑5－azaC處理可以使甲基化水平降低，DNA去甲基化是導(dǎo)致植物異常表型的主要原因。前人在研究 5－azaC 處理擬南芥種子［11］、亞麻種子［12］、甘藍(lán)幼苗［13］、小麥幼苗［10］時(shí)，結(jié)果顯示：植株經(jīng) 5－azaC處理后DNA甲基化水平降低，可見(jiàn)植株矮化、株成叢狀、葉片變小等異常性狀，并且可以遺傳給后代。在本試驗(yàn)中，花椰菜幼苗經(jīng)不同濃度的5－azaC處理后沒(méi)有發(fā)現(xiàn)枯萎或死亡現(xiàn)象，但是一定濃度（20～40 mg／L）的5－azaC處理可使花椰菜植株出現(xiàn)植株矮化、葉片變小、提早現(xiàn)蕾、植株叢狀等異常性狀，其中對(duì)青花較為明顯，這可能是青花相對(duì)白花對(duì)5－azaC處理更為敏感，5－azaC處理后引起了DNA甲基化水平降低，從而導(dǎo)致了表型異常，而且這種抑制作用存在一定劑量累計(jì)效應(yīng)。此外，經(jīng)過(guò)一定濃度5－azaC處理后，花椰菜的株高、株幅、現(xiàn)蕾時(shí)間、花蕾直徑、單球質(zhì)量明顯異于對(duì)照，這說(shuō)明適宜濃度的5－azaC處理可以獲得一些理想的表型，這些表型變化假如可以遺傳，則可能用于下一步育種。

DNA甲基化與植物春化作用及開(kāi)花密切相關(guān)。Burn等［14］采用5－azaC處理尚未春化的擬南芥植株后，處理組比對(duì)照組提前開(kāi)花，而對(duì)春化作用不敏感的晚開(kāi)花材料對(duì)5－azaC處理無(wú)明顯變化。本試驗(yàn)結(jié)果表明：一定濃度的5－azaC處理可以促進(jìn)花椰菜（包括青花和白花）提早現(xiàn)蕾和開(kāi)花，提早時(shí)間在3～8 d之間；不同濃度不同材料之間花椰菜提前現(xiàn)蕾的天數(shù)各有差異，但均比對(duì)照組有所提前；不同材料對(duì)5－azaC的敏感程度反應(yīng)不同。這與擬南芥［10］、小麥［15］、蘿卜［16］、白菜［17］等植物的研究結(jié)果一致，說(shuō)明DNA甲基化水平的降低可以促進(jìn)植物提早現(xiàn)蕾開(kāi)花。Finnegan等［18］研究認(rèn)為：僅甲基化水平降低就可以使植物開(kāi)花，這說(shuō)明在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，存在一些與開(kāi)花相關(guān)基因啟動(dòng)子DNA去甲基化，活化基因表達(dá)導(dǎo)致DNA甲基化水平降低，進(jìn)而促進(jìn)植物開(kāi)花，但是具體的開(kāi)花機(jī)制尚不清楚。本研究以花椰菜（包括青花和白花）為材料，通過(guò)對(duì)5葉1心幼苗進(jìn)行DNA甲基化抑制劑5－azaC處理，達(dá)到了提早現(xiàn)蕾和開(kāi)花等理想效果，這對(duì)解決花椰菜雜交育種中親本花期不遇具有重要作用。目前還只是研究初始階段，而對(duì)于甲基化水平具體下降了多少，DNA甲基化相關(guān)基因如何調(diào)控等，還需要進(jìn)一步深入研究。

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