不同十字花科作物氣孔保衛細胞周長和葉綠體數目與其倍性的相關性研究

胡靖鋒，蘭 梅，徐學忠，楊紅麗，張麗琴，劉家佳，趙 穎，和江明*

體細胞融合、花藥培養、小孢子培養等再生植株都需要進行倍性鑒定，常用的方法包括流式細胞儀檢測［1－2］、植株形態學觀察［2］、根尖染色體計數［3］等。流式細胞儀測定結果準確可靠，但是費用較高，不易普及；植株形態學觀察周期較長，易受環境等因素影響；根尖染色體計數程序較復雜，且需具有一定理論基礎和熟練的操作才能獲得可靠的結果，不易大量使用。而利用氣孔保衛細胞及葉綠體數目鑒定植株倍性是一種既經濟又有效簡便的鑒定方法。目前，在大麥［4］、辣椒［5］、枇杷［6］、何首烏［7］等作物上已有相關的研究。本研究通過對不同十字花科作物葉片氣孔保衛細胞周長及葉綠體數目與其倍性關系的研究，分析它們之間的差異，找到一種快速、簡便、準確鑒定十字花科作物倍性的方法，為十字花科作物倍性鑒定提供有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

由云南省農科院園藝所提供的試驗材料是油菜材料 N001、N002，青梗菜材料 CPC001、CPC002，春菜材料KC01；以及油菜材料、青梗菜材料、春菜材料的小孢子培養再生植株N003、CPC003、KC02。

1.2 試驗方法

1.2.1 氣孔保衛細胞橫縱徑及外周長的觀察 當植株有4～5片真葉長出后，用鑷子小心撕下葉片下表皮，放到滴有一滴清水的載玻片上，用蓋玻片壓片后置光學顯微鏡下觀察。對同一葉片不同部位取樣時，將葉片分為上、中、下三等分，分別進行取樣。通過目鏡測微尺測出縱徑、橫徑，并作記錄，計算葉片氣孔保衛細胞外圍周長。

氣孔保衛細胞的外圍周長（L）計算公式：

L＝1.57×［1.5×（A＋B）－（A×B）1／2］

公式中L為氣孔保衛細胞的外圍周長，A、B分別代表整個氣孔保衛細胞橫、縱徑［8］。

1.2.2 氣孔保衛細胞葉綠體數目觀察 對各材料的單倍體、二倍體植株進行葉片取樣，葉片取上、中、下3個部位，從第4片真葉完全長出開始，撕取樣葉的下表皮于載玻片上，并用1%碘－碘化鉀染色，加蓋玻片后，顯微鏡下計數氣孔保衛細胞內的葉綠體數目［9］。

2 結果與分析

2.1 不同十字花科作物二倍體植株葉片氣孔保衛細胞周長的比較

從表1可以看出，不同材料葉片氣孔保衛細胞周長之間存在差異。油菜N001的氣孔保衛細胞周長最大為75.47μm；其次是油菜N002，其氣孔保衛細胞周長為72.06μm；青梗菜CPC001的氣孔保衛細胞周長為67.33μm；青梗菜CPC002的氣孔保衛細胞周長為62.86μm；春菜KC01的氣孔保衛細胞周長為65.82μm；CPC002的氣孔保衛細胞周長最小。通過方差分析，各研究材料間的氣孔保衛細胞周長差異顯著。

表1 不同十字花科作物二倍體植株葉片氣孔保衛細胞周長的比較 μm

2.2 不同十字花科作物單倍體植株葉片氣孔保衛細胞周長的比較

對油菜、青梗菜、春菜單倍體植株葉片氣孔保衛細胞周長進行比較，結果表明（表2）：各材料的氣孔保衛細胞周長存在差異。N003的氣孔保衛細胞周長為50.74μm，CPC003的氣孔保衛細胞周長為47.47 μm，KC02的氣孔保衛細胞周長為44.21μm。在3種材料中，氣孔保衛細胞周長最大的是N003（油菜），其次是CPC003（青梗菜），KC02（春菜）的最小。通過方差分析，3種材料的氣孔保衛細胞周長之間差異顯著。

表2 不同十字花科作物單倍體植株葉片氣孔保衛細胞周長的比較 μm

2.3 單倍體與二倍體植株氣孔保衛細胞周長的比較

以KC01、KC02為供試材料，對其植株氣孔保衛細胞周長進行了比較，結果表明：春菜材料單倍體、二倍體植株的葉片上部、中部、下部間氣孔保衛細胞周長大小差異不明顯，但單倍體與二倍體之間葉片氣孔保衛細胞周長大小差異比較明顯。KC01植株的葉片上部、中部、下部氣孔保衛細胞周長分別是65.59、67.54、64.32μm，KC02植株葉片氣孔保衛細胞周長分別是 44.89、42.23、45.51 μm（圖 1）。 通過觀察葉片氣孔保衛細胞周長區別單倍體與二倍體植株較為簡便。

圖1 單倍體與二倍體植株氣孔保衛細胞周長比較

2.4 葉片不同部位氣孔保衛細胞葉綠體數目的比較

由表3可以看出，同一材料葉片不同部位氣孔保衛細胞葉綠體數目差異不明顯，各材料間的葉片氣孔保衛細胞葉綠體數目不同，存在明顯差異。材料N001、CPC001、KC01的葉綠體數目均在10個以上，N003、CPC003、KC02的葉綠體數目均在10以下。經方差分析，各材料的葉片保衛細胞葉綠體數目差異顯著。

表3 不同材料葉片不同部位氣孔保衛細胞葉綠體數目的比較 個

2.5 不同倍性植株氣孔保衛細胞葉綠體數目的差異

對試 驗 材 料 N001、N003、CPC001、CPC003、KC01、KC02進行葉片保衛細胞葉綠體數目觀察，試驗材料間葉綠體數目存在差異，葉綠體數目分別為14、7、12、8、13、7 個。 二倍體材料為 N001、CPC001、KC01，單倍體材料為 N003、CPC003、KC02。 對試驗材料進行葉綠體數目鑒定與形態學鑒定，確定倍性比較鑒定結果一致性，說明葉綠體數目鑒定植株倍性是可行的。

表4 不同倍性植株氣孔保衛細胞葉綠體數目鑒定與形態學鑒定的一致性

3 討論

利用氣孔保衛細胞鑒定植物倍性是一種便捷的方法，許多前人在多種作物上研究了氣孔保衛細胞長度與倍性的關系。何婷等［10］對甘藍型油菜種子萌發的二倍體植株和小孢子來源再生單倍體植株的不同葉位葉片氣孔保衛細胞大小進行了測定，考察了不同葉片的保衛細胞長軸長、短軸長以及其周長差異，并對氣孔保衛細胞大小與植株倍性的相關性進行了研究。結果表明：油菜單倍體與二倍體葉片氣孔保衛細胞的長軸長、短軸長以及其周長存在顯著差異，利用長軸與短軸長度計算的周長指標對單倍體與二倍體鑒定具有更寬的區分窗口，可用于油菜雙單倍體群體構建中植株倍性的快速鑒定。魯文英等［11］以飼用甜菜二倍體和四倍體為試驗材料，研究了氣孔的長、寬度與倍性的關系，結果表明：二倍體植株與四倍體植株的氣孔長、寬度之間差異顯著。可作為飼用甜菜多倍體育種初期的篩選鑒定指標。祁魏崢等［12］以流式細胞儀的結果為基準，對再生植株葉片氣孔保衛細胞周圍葉綠體數目，保衛細胞長、寬及其周長進行了研究，結果表明：在保衛細胞長度和周長均能說明倍性的情況下，通過測量保衛細胞的長度來判定倍性更為簡便。本研究對油菜、青梗菜、春菜單倍體及二倍體氣孔保衛細胞橫、縱徑及周長進行研究比較，單倍體和二倍體氣孔保衛細胞橫、縱徑、周長數值差異顯著，且與前人研究結果相似。各研究作物間的氣孔保衛細胞橫、縱徑及周長間也存在差異；各作物同一葉片不同部位氣孔保衛細胞橫、縱徑及周長間差異不顯著。

圖2 不同倍性植株葉片氣孔保衛細胞葉綠體數目

在氣孔保衛細胞葉綠體數目與倍性之間關系的研究方面，魯文英等［11］以飼用甜菜二倍體和四倍體為試驗材料，研究了氣孔保衛細胞葉綠體數目與倍性的關系，結果表明：二倍體與四倍體植株的氣孔保衛細胞葉綠體數目間差異顯著。施先鋒等［13］以二倍體西瓜及其同源四倍體為材料，通過觀察葉片氣孔保衛細胞葉綠體數來鑒定西瓜染色體倍性，結果表明：二倍性間的葉綠體數差異顯著。張凌媛等［14］以16個枇杷品種的二倍體和自然多倍體為試材，研究了氣孔保衛細胞葉綠體數目和氣孔密度與倍性的相關性，結果表明：氣孔密度與倍性相關性不顯著；多倍體氣孔葉綠體數比二倍體有明顯增多，差異均達極顯著水平，而多倍體之間差異不顯著；品種間葉綠體數有明顯差異，各品種葉綠體數分布有近似規律。閔子揚等［15］以南瓜胚囊再生植株為材料，采用形態學鑒定法、根尖染色體計數法和氣孔保衛細胞葉綠體計數法3種方法對46株南瓜胚囊再生植株的倍性進行鑒定，結果表明：形態學鑒定法只能作為倍性鑒定的一種輔助方法，而染色體計數法雖直接、準確，但效率低，氣孔保衛細胞葉綠體計數法高效、簡便。胡婷婷等［16］對粳稻F1代花培植株進行倍性鑒定，結果表明：苗期利用印記液撕取法，觀察花培植株的氣孔形態、大小以及保衛細胞的葉綠體數并輔以形態學鑒定，是粳稻花培植株群體早期倍性快速判別的簡單有效的辦法。本研究對各作物葉片不同部位保衛細胞葉綠體數目以及葉綠體計數與植株形態鑒定進行比較，同一材料葉片不同部位氣孔保衛細胞葉綠體數目差異不明顯，各材料間的葉片氣孔保衛細胞葉綠體數目差異明顯。保衛細胞葉綠體計數與植株形態鑒定倍性結果相吻合。另外，在植株倍性鑒定過程中，采用無菌水處理材料，更容易對葉綠體進行觀察計數。

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