葡萄miR159家族生物信息學分析及靶基因預測分析

葛金濤，王麗麗，趙統利，劉興滿

微小 RNA（MicroRNAs）是一類非編碼小分子RNA，無論在植物還是動物的生長發育過程中都發揮著重要的調控作用［1］。miR159是已經被證實的8個高度保守的miRNA之一，其在GA信號途徑中起到重要的調控作用［2］。

植物MiR159家族對應的靶基因主要為MYB－like和MYB。研究表明在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，已經通過實驗驗證有8個MYB基因受到miR159的調控，其中有7個屬于GAMYB家族［3］。另外，在擬南芥中，miR159通過間接調控靶基因MYB33、MYB65以及 MYB101來控制擬南芥的根長［4］；在擬南芥中過表達 miR159a，其靶基因 MYB33和MYB65的表達量均呈下降趨勢，說明兩者均受到miR159a的調控；在水稻（Oryza sativa）中共有3個GAMYB－like的同源基因，靶基因預測結果表明，miR159與這3個基因均存在相互作用的位點；另外，在水稻中miR159的表達量與GAMYB－like1和GAMYB的表達量呈負相關［5］。在谷物絨氈層細胞中有較多的受GA調控的GAMYB蛋白，兩者相互作用共同參與調節細胞程序性死亡，在植物花藥及種子的發育中有重要的調控作用［6］。miR159的表達并非貫穿于水稻的整個生長發育過程中，在水稻種子階段未檢測到其表達情況。在GA信號轉導過程中，GA調控LFY基因的表達是通過作用結合在LFY基因啟動子上的GAMYB作用元件實現的。另外研究表明，在短日照下施用GA可激活LFY基因的啟動子活性，從而促進植物開花［7］。大巖桐 miR159與SsGAMYB的相互作用影響了大巖桐的開花時間［8］。因此表明，miR159與其靶基因GAMYB轉錄因子之間的互作可能在植物種子萌發、成花誘導等過程中有重要的作用。

在金魚草（Antirrhinum majus L.）等植物的研究中發現，在植物花發育過程中，GA的信號轉導是其中重要的一個環節，而GAMYB是GA信號轉導中關鍵作用因子，miR159通過介導其表達量間接發揮調控作用［9］。葡萄（Vitis vinifera）是具有較高經濟價值的果樹之一，但目前有關葡萄miR159和GAMYB的相關研究尚未見詳細報道。隨著生物信息學與分子生物學的快速發展，對植物全基因組數據中非編碼基因及其靶基因的挖掘、檢測、定位等已越來越成為研究的熱點。本研究利用生物信息學分析方法初步分析了葡萄miR159家族的系統發生規律、結構預測、靶基因預測等，進而推測其功能與葡萄生長發育過程之間的關系，以期從非編碼基因角度為今后葡萄的遺傳改良育種提供新的理論依據。

1 材料和方法

1.1 序列獲得

在數據庫miRbase 21.0中下載葡萄、水稻、大豆（Glycine max）、碧桃（Prunus persica）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、番茄（Solanum lycopersicum）的miR159家族成員的成熟序列和前體序列。

1.2 vvi－miR159家族的基因定位

利用NCBI數據庫BLAST在線工具，在葡萄基因組數據庫中對其miR159前體序列進行相似序列搜索（BLAST Assembled RefSeq Genomes）。根據最終的序列匹配結果，對葡萄miR159家族成員進行基因組定位。

1.3 vvi－miR159家族進化分析及堿基保守性分析

利用ClustalW2在線工具對相關miR159基因家族前體序列進行比對。在WebLogo在線平臺輸入葡萄miR159家族的成熟序列，分析其堿基保守性，并繪制序列Logo圖。利用MEGA 6.0多序列比對結果，采用鄰近法（Neighbor－joining，NJ）構建相關植物物種miR159家族的系統發育進化樹，重復值設置為1000。

1.4 vvi－miR159家族前體二級結構預測分析

在RNAfold WebServer平臺上預測葡萄miR159家族成員的前體二級莖環結構，采用默認參數值。

1.5 vvi－miR159家族的靶基因預測

通過psRNATarget平臺對靶基因進行預測。提交葡萄miR159家族的成熟序列，選擇psRNATarget軟件中提供的葡萄JGI數據庫作為目標基因搜索庫，采用默認參數，預測其目標基因；另外在GenBank中對目標基因功能進行注釋，初步確定其功能。

2 結果與分析

2.1 葡萄miR159家族的基因定位

由表1可知，葡萄miR159基因主要分布于葡萄基因組的兩條染色體（Chr）上；其中 vvi－miR159a和vvi－miR159b均分布在 Chr15 上，而 vvi－miR159c分布于Chr17上。

表1 葡萄vvi－miR159基因家族的成熟序列及其基因定位

2.2 進化樹構建結果

建立基于水稻、葡萄等物種miR159家族的系統發育樹。結果（圖1）顯示：水稻osa－miR159和玉米zma－miR159家族成員分別聚類到一起；葡萄 vvimiR159家族3個成員（已標注）中vvi－miR159a和vvi－miR159b聚類在一起，與大豆 gma－miR159家族成員的遺傳關系較近；而vvi－miR159c分布于另一個進化分支上，與碧桃ppe－miR159聚類在一起，與葡萄家族的另外兩個成員間遺傳距離相對較遠。結合vvimiR159基因定位結果，發現位于同一條染色體（Chr15）上的 vvi－miR159a 和 vvi－miR159b聚類在一個分支，而位于染色體（Chr17）上的 vvi－miR159c則聚類在較遠的分支，兩者結果一致，符合植物基本進化規律，同時也說明染色體間的miR159基因復制應該早于同一條染色體上的基因復制。

2.3 二級結構預測結果

二級結構預測結果（圖2）表明，葡萄vvi－miR159家族成員的前體序列都可以形成穩定的莖環結構，且其3個成員的成熟序列都產生在其對應前體序列的5′端臂上。

2.4 成熟序列堿基的保守性分析

對植物miR159的91個家族成員（圖3A）以及葡萄的3個家族成員（圖3B）的成熟序列進行堿基保守性分析。結果表明，植物miR159家族的標準序列為 5′－UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA－3′，且在 2～20位堿基處保守性整體較高。葡萄vvi－miR159家族成員成熟序列的堿基種類基本上與標準序列一致（圖3B），其中vvi－miR159c的堿基種類與標準序列完全一致，vvi－miR159a和 vvi－miR159b成熟序列的堿基種類與標準序列基本一致，僅在第1、7以及21位堿基與標準序列存在差異（U轉為C；U轉為G；A轉為C）。說明葡萄miR159家族成員成熟序列的堿基保守性較高。

圖1 基于前體序列構建的系統進化樹

圖2 二級結構預測結果

2.5 靶基因預測結果

經在線平臺預測，在葡萄 JGI基因庫中，vvimiR159家族成員都預測到有目標基因存在，對應的目標基因有2個，分別為GSVIVT01012447001和GSVIVT01037362001（表2）。 在NCBI中通過 BLAST進行功能預測，結果表明GSVIVT01012447001為GAMYB轉錄因子家族成員，而GSVIVT01037362001的功能目前尚未得到確認。據此可初步推斷，葡萄miR159與其靶基因之間的互作在植物花期調控、根發育等過程中發揮重要調控作用。

圖3 植物miR159家族成員及葡萄miR159家族成員成熟序列的堿基保守性分析結果

3 結論與討論

自從Llave等［10］2002年首次在擬南芥中克隆到miRNA后，越來越多的研究發現，miRNA不僅在植物應對逆境脅迫反應過程中有重要的調控作用，而且還參與調控植物的生長發育過程，包括植物葉片形態建成、花期［11］以及花器官［12］的變化等。 目前，主要有三類miRNA在植物開花過程中發揮主要作用，分別為miR172、miR159和 miR156。 這3種 miRNA是植物在成花期重要的調控因子，其中miR159主要通過GA信號途徑介導相關開花基因的表達［13］。

本文通過對葡萄vvi－miR159家族成員的前體序列進行系統發育進化分析，結果發現與基因定位分析結果一致；另外對葡萄vvi－miR159的前體序列進行二級結構預測，對其成熟序列的堿基保守性以及目標基因進行分析預測，結果顯示，葡萄miR159家族成員的前體序列都可形成穩定的二級結構，且其對應成熟序列的堿基基本上與miR159家族的標準序列保持一致，即植物miR159的成熟序列在不同物種中差異很小，這與李曉燕等［14］在大巖桐中的研究結果相同。靶基因預測結果表明葡萄miR159家族的主要目標基因為GSVIVT01012447001，經功能預測分析，發現其為GAMYB轉錄因子家族成員，這與在大麥（Hordeum vulgare）、水稻［5］、擬南芥［15］、馬鈴 薯 （ Solanum tuberosum）［16］、草莓（Fragaria ananassa Duch.）［17］以及落葉松屬［18］植物中的研究結果相一致。

表2 葡萄miR159家族成員與其對應的靶基因

但近期有實驗表明，在短日照條件下，擬南芥miR159ab雙突變體中，MYB33和MYB65兩個基因的表達量都上調，開花時間出現了延遲現象，而在myb33－myb65突變體植株中，花期相對于野生型植株無變化；外施GA后，myb33－myb65功能缺失突變體表型也沒有發生變化，開花時間提前20 d左右，但miR159ab雙突變植株花期沒有變化，說明在擬南芥中MYB33和MYB65并不是控制開花途徑的關鍵基因。水稻gamyb突變植株在正常培養條件下，抽穗期和花期都未發生變化，據此表明GAMYB在植物花期調控中的作用較為復雜，仍有待于探索［19］。

另外，miRNA及其靶基因之間的調控是一個極為復雜的網絡；另外，最新研究表明，circular RNA（環形RNA）中富含miRNA的結合位點，可在細胞中結合相應的miRNA，從而影響miRNA靶基因的表達水平［20］。本研究中發現葡萄 vvi－miR159的主要靶基因是GAMYB家族，但是葡萄vvi－miR159c對應的靶基因功能尚未確定，因此葡萄miR159c是否還參與對其他類型的靶基因的調控，是否還參與葡萄其他生長發育的調控過程還有待進一步確認。此外，有相關研究［21］表明，植物miR159成熟序列5′端的第10和第11位堿基之間存在對目標基因的剪切作用位點，但在葡萄中miR159的作用位點是否有時空與物種特異性，這有待深入探索分析。本文首次對葡萄vvimiR159家族進行了初步的生物信息學分析，并對其靶基因進行了初步在線預測。今后仍有必要進一步采用轉基因技術對葡萄vvi－miR159及其靶基因的功能與互作關系進行更加深入的探討，從而從非編碼基因角度為今后葡萄新品種改良與選育提供新的參考。

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